不同腌制方式对盐水鹅生坯保水性及蛋白质氧化的影响

张 桓，许志诚,2，张兆丽,2，还传明，高东辉，苏 畅，孟祥忍,2,*

（1.扬州大学旅游烹饪学院，江苏扬州 225127；2.中餐非遗技艺传承文化和旅游部重点实验室，江苏扬州 225127）

盐水鹅是扬州传统腌制美食。腌制是制作盐水鹅的重要环节，也是调理肉制品加工中常用的一种加工技术。通过腌制处理可以改善肉制品风味、色泽和品质，提高腌制效率和货架期[1]。传统的腌制方式是在外界环境下直接进行常规静置腌制，缺少促进食盐渗透的有效手段[2]，存在腌制时间长、出品质量不稳定、营养及风味物质流失、腌制过程中会受到微生物污染的问题，缺乏高效产业化生产预制品的能力。

超声波、滚揉腌制加工可以提高腌制效率、肉类品质和降低微生物污染，目前被广泛运用于工业化食品腌制生产中。超声波加工过程中利用功率超声波在介质中传播时的空化效应瞬间产生高温和压力加快物质的转移等，从而提高腌制效率，对于肉制品肌肉分子结构和品质产生一定影响[3]。真空滚揉加工是将抽真空加工与滚揉加工相结合，肉制品在真空条件下的滚揉机滚筒中碰撞的机械作用力，使肉制品肌肉组织发生改变，细胞膜渗透性增强，从而加快腌制速率，提高肉制品品质。Li 等[4]实验证明超声和滚揉有协同效果；李鹏等[5]认为超声波辅助变压滚揉加快蛋白降解提高鸭肉的保水性，改善鸭肉品质。

目前，肉制品腌制处理鲜有对超声联合滚揉腌制以及对不同腌制方式对肉制品肌原纤维蛋白氧化影响的探究，本文通过对盐水鹅生坯不同的腌制方式进行腌制处理，测定其保水性的能力、微观结构和蛋白氧化（羰基、表面疏水性、SDS-PAGE、总巯基）的影响，分析适宜腌制方式，为盐水鹅生坯腌制方式的优化和工业化生产提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻濮阳鹅 雄性日龄90 d，体重4±0.5 kg，濮阳市华信食品有限公司；盐、青红花椒、香叶、桂皮、八角、陈皮、白芷、茴香、丁香、草果、鸡精、肉豆蔻粉、大蒜粉、鸡汁、料酒、生姜、葱 扬州麦德龙超市；鹅骨提取物（食品添加剂）青岛海润隆食品添加剂有限公司；D-抗坏血酸钠（食品添加剂）江西省德兴市百勤异VC 钠有限公司；氯化钠、三氯乙酸、溴酚蓝、盐酸胍、乙酸乙酯、多聚甲醛、盐酸、氢氧化钠、β-巯基乙醇、尿素、5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris、乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

RC-1000LG 五频超声波卤煮锅 河北仁川科技有限公司；HKS-30VT 真空滚揉机 无锡哈克逊工贸有限公司；PR224ZH/E 电子分析天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；BIO-RAD 型伯乐电泳仪 北京赛百奥科技有限公司；HH-4A 数显恒温水浴锅江苏金坛市环宇科学仪器厂；VORTEX 1 型涡旋混匀仪 艾卡（广州）仪器设备有限公司；TGL-16M 高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机有限公司；P1 紫外分光光度计 上海美普达仪器有限公司；BCD-346 型海尔冰箱 青岛海尔有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 工艺流程：冷冻鹅→解冻、预处理→浸泡血水1 h→腌制2 h（5 种腌制方法）→真空包装→巴氏杀菌→指标检测。

将5 只冷冻鹅于4 ℃条件下解冻8 h 并完成去除内脏和清洗的预处理，预处理好的光鹅在4 ℃的水中浸泡1 h 去除血水，浸泡完成的光鹅分别进行5 种腌制处理，腌制完成后进行真空包装（真空时间15 s，真空度-0.1 MPa）并进行巴氏消毒（65 ℃的水浴30 min）。

腌制液的配方（以水质量为百分比），食盐9.5%，桂皮、八角和茴香各0.06%，青红花椒0.41%，陈皮0.03%，白芷、鹅骨提取物各0.08%、丁香0.008%、草果0.04%、鸡精0.5%、肉豆蔻0.016%、大蒜粉0.1%、鸡汁0.25%、料酒2%、葱、姜各0.1%[6]。腌制液浸没样品即可。

腌制方式参照孟祥忍等[7]的方法修改。试验设置以下处理组：常规处理组（常规），浸没在腌制液中静置2 h；真空滚揉处理组（G），滚揉处理0.5 h、真空度为0.08 MPa、15 r/min，腌制液中静置1.5 h；加盐滚揉处理组（G+NaCl）。在滚揉腌制的基础上加食盐、香叶、桂皮，调料总量不变；超声联合真空滚揉处理组（G+C），滚揉处理0.5 h、真空度为0.8 MPa、15 r/min，超声处理 1.5 h、90 kHz；超声辅助处理组（C），超声处理 2 h、90 kHz。

1.2.2 烹煮损失测定 将腌制好的鹅肉样品称取质量为M1并密封在蒸煮袋中，放入80 ℃条件下的水浴锅中加热20 min，直到肉块中心温度达到75 ℃，将熟肉块冷却至室温，用滤纸吸干表面水分，准确称重并记为M2，使用蒸煮损失计算公式（1）：

1.2.3 离心损失率测定 将腌制后的鹅肉样表面水分吸干，取肉样中心部位，取1 g 的鹅肉样品用滤纸包裹，放置于内有脱脂棉的50 mL 离心管中，并用脱脂棉配平。在离心机中用转速3000 r/min，在4 ℃下离心时间10 min。称量离心前记为M3离心后记为M4，计算按公式（2）进行：

1.2.4 微观结构观察 参照孟祥忍等[7]的方法修改，将处理过的鹅胸肉样品切成5 mm×5 mm×3 mm 的颗粒，用4%的多聚甲醛固定12 h 后制作石蜡切片。采用200 倍光学显微镜观察样本切片结构并拍照。

1.2.5 肌原纤维蛋白的提取 肌原纤维蛋白的提取参照高子武等[8]的方法，并稍作修改。取不同腌制方式处理过的鹅肉8 g 剪碎后加入4 倍体积的磷酸盐缓冲液（pH7.0，其中含0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Na3PO4·12H2O，10 mmol/L NaH2PO4·2H2O，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L 乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA））混合均匀，在15000 r/min 30 s 冰浴条件下均质2 次，期间暂停5 s，挑出残留筋膜后，离心（4 ℃，2000 ×g）10 min 后弃上清液，重复上述操作3 次；取沉淀再用4 倍体积0.1 mol/L NaCl 混匀，重复上述冰浴均质和离心操作步骤2 次，弃去上清液所得沉淀即为肌原纤维蛋白。

1.2.6 表面疏水性测定 根据孟嘉珺等[9]的方法稍加修改。将1 mL 浓度为5 mg/mL 肌原纤维蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL 溴酚蓝溶液，空白对照组1 mL 磷酸盐缓冲液加入200 μL 1 mg/mL 溴酚蓝溶液，涡旋振荡混匀10 min 后离心（4 ℃，5000 ×g，10 min），取上清液稀释10 倍后在595 nm 处测定吸光值，表面疏水性计算如公式（3）所示：

式中：A空白为空白样品的吸光度值；A样品为样品的吸光度值。

1.2.7 总巯基含量测定 参照Yongsawatdigul 等[10]方法适当修改。取1 mL 浓度为2 mg/mL 肌原纤维蛋白溶液，加入9 mL 的磷酸盐缓冲液混匀，取出4 mL 混合液中加入0.4 mL 0.1%的5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）DTNB 溶液，振荡摇匀后在40 ℃条件下水浴反应25 min，并在412 nm 波长下测定吸光值。总巯基含量按式（4）计算得到。

式中：A412为420 nm 下的吸光值；e为分子吸光系数，13600 L/mol·cm；D为水浴前稀释倍数；c为蛋白浓度，mg/mL。

1.2.8 蛋白质羰基含量测定 参考Fu 等[11]方法适当修改。取1 mL 浓度为5 mg/mL 肌原纤维蛋白溶液，加入1 ml 10%的三氯乙酸（TCA），振荡摇匀后4 ℃离心（4 ℃，10000×g，5 min），弃上清液，在沉淀中加入1 mL 2,4-二硝基苯肼（DNPH）（2 mol/L 盐酸，0.2% DNPH），室温下反应1 h，以2 mol/L HCl溶液为空白对照组，然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸（TCA）溶液，振荡摇匀后离心（4 ℃，10000×g，5 min），弃上清液，蛋白质沉淀用乙醇-乙酸乙酯溶液（体积比1:1）洗涤沉淀3 次。在蛋白质沉淀中加入1 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液，振荡摇匀，在37 ℃条件下水浴30 min 后离心（4 ℃，10000×g，5 min），保留上清液在370 nm 处测定吸光度。羰基含量按式（5）计算得到。

式中：A 为样品在370 nm 波长处的吸光度；n 为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数22000/（L/（mol·cm））；ρ为蛋白质质量浓度（mg/mL）。

1.2.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 参考陈春梅等[12]方法适当修改，将提取的肌原纤维蛋白配制成4 mg/mL 的蛋白液与buffer 缓冲液混匀，在100 ℃条件下水浴10 min。冷却至室温，上样前离心（4 ℃，3000×g，30 s），取上清液。采用5%浓缩胶、12%分离胶。蛋白质预染Marker 作为蛋白质电泳分子量标准，在浓缩胶时80 V 恒压，在分离胶110 V恒压，直至结束。取出胶片浸泡在考马斯亮蓝染色溶液中染色再脱色处理。

1.3 数据处理

本次试验进行三次重复实验，测量各实验的数据并计算出平均值和标准偏差，并使用Graph Pad Prism 8 软件绘制相关图表。使用SPSS 24.0 软件进行差异显著性分析，采用邓肯式对不同处理组间的差异进行统计学分析，确定显著性检验标准P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同腌制方式对盐水鹅生坯保水性的影响

鹅肉的保水性与其嫩度和品质等密切相关[13]，由图1 可知，常规腌制、真空滚揉腌制、超声波腌制、加盐真空滚揉腌制和超声波联合滚揉腌制5 组鹅肉之间的离心损失和蒸煮损失都存在显著差异（P＜0.05）。与常规腌制相比，滚揉腌制和超声联合滚揉腌制显著降低了鹅肉的蒸煮损失（P＜0.05），且超声联合滚揉腌制以后，鹅肉蒸煮损失略高于滚揉腌制，可能是因为鹅肉受超声波与滚揉的联合机械力作用，鹅肉肌肉结构和肌纤维细胞中蛋白质的破坏较滚揉腌制的更严重，从而蒸煮损失增大[14]。与常规腌制相比，加盐滚揉腌制和超声联合滚揉腌制显著降低了鹅肉的离心损失，超声联合滚揉腌制离心损失最低，可能是因为滚揉中加入NaCl，增加鹅肉盐溶性蛋白析出，导致鹅肉保水能力减弱。超声和滚揉腌制技术促进鹅肉肌肉组织间隙增大，提高了鹅肉保水性。这与佟荟全等[15]、Zou 等[16]的研究结果相似，因而推测超声波联合滚揉腌制一定程度上可以增强鹅肉的保水性。

图1 不同腌制方式对盐水鹅生坯保水性的影响Fig.1 Effects of different pickling methods on water retention of salted goose raw material

2.2 不同腌制方式对盐水鹅生坯微观结构的影响

肌纤维间隙决定肌纤维结构松散程度，直观反映肌肉嫩度[17]。如图2 所示，常规腌制的肌肉纤维间隙紧密，肌纤维完整，经过其他腌制方式的鹅肉肌肉纤维间隙增大，出现一定程度的部分裂解，宏观表现为嫩度的改善，加盐滚揉腌制与超声联合滚揉腌制的肌肉纤维出现较大间隙，是由于滚揉和超声的机械作用，使得存在于间隙中盐溶性蛋白不断吸水膨胀，迫使间隙增大[18]。超声联合滚揉腌制的肌肉纤维结构破坏程度最大，肌纤维间隙增大。这可能是由于NaCl 的生化效应及滚揉与超声的机械力共同作用，使得肌纤维裂解和间隙增大，呈现不规则状态[15]。Li 等[4]研究表明一定程度的肌肉纤维破裂和肌纤维间距增大能显著改善肉类嫩度。

图2 不同腌制方式对盐水鹅生坯微观结构的影响Fig.2 Effect of different pickling methods on the microstructure of salted goose green body

2.3 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性是肉类肌原纤维蛋白的重要性质，能够反映其氧化程度和结构稳定性，其值越小，说明肌原纤维蛋白保水能力强，蛋白氧化程度低，蛋白结构稳定性好，如图3 可知，运用不同腌制方式处理对鹅肉肌原纤维蛋白表面疏水性差异显著（P＜0.05），其他腌制方法均明显高于常规腌制，这是由于滚揉和超声的腌制方式破坏了肌肉的组织结构，蛋白质三级结构展开，使得肌原纤维蛋白疏水基团暴露，导致蛋白质表面疏水性增大[19]。这与吴倩蓉等[20]研究相一致。在腌制处理组中，超声联合滚揉腌制的肌原纤维蛋白表面疏水性显著低于其他腌制方式（P＜0.05），可能由于超声联合滚揉腌制的空化效应和机械力作用加速蛋白内部分子交联形成聚合物，导致蛋白质的酶解降低，减少疏水基团暴露，肌原纤维蛋白表面疏水性下降。

图3 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.3 Effect of different pickling methods on the surface hydrophobicity of goose myofibril protein

2.4 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白总巯基的影响

总巯基是暴露于蛋白质表面的活性巯基和存在于分子内部的巯基，总巯基含量是表征蛋白氧化程度的关键指标之一[8]，在腌制加工过程中，总巯基容易氧化形成二硫键[21]，这种氧化反映可以促进蛋白质分子间的交叉、联结和聚合[22]。由图4 可知，超声腌制和超声联合滚揉腌制分别与常规腌制无差异（P＞0.05），但加盐滚揉腌制总巯基含量显著性高于真空滚揉腌制（P＜0.05），可能是在滚揉过程中添加NaCl促进肌原纤维的崩解[23]，影响蛋白结构伸展，更多巯基氧化成为二硫键[22]。此外，超声联合滚揉腌制的鹅肉肌原纤维蛋白总巯基含量最高，可能是滚揉腌制破坏肌肉组织，部分的盐溶性蛋白析出，在超声的作用下结合了鹅肉中的结合水，形成保护膜从而抑制巯基基团被氧化，降低肌原纤维蛋白氧化程度[24]。

图4 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白总巯基的影响Fig.4 Effect of different pickling methods on the total sulfhydryl group of goose myofibrillar protein

2.5 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白羰基的影响

肌原纤维蛋白羰基的含量是衡量蛋白质氧化程度的关键指标之一，羰基含量的高低可以反映蛋白质分子的氧化程度和稳定性[25]。由图5 可知，常规腌制与其他处理组有显著性差异（P＜0.05），说明经过滚揉、超声腌制处理后羰基含量增多，蛋白氧化程度增大。加盐滚揉腌制的肌原纤维蛋白羰基含量最多，可能是因为滚揉腌制一定程度上改变了肌原纤维蛋白的空间构象，盐溶液加速脂质的氧化进程[7]，脂质氧化产物与肌原纤维蛋白结合形成羰基，导致羰基含量增多[26-27]。

图5 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白羰基的影响Fig.5 Effect of different pickling methods on carbonyl of goose myofibrillar protein

2.6 不同腌制方式对鹅肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE的影响

肌原纤维蛋白主要由肌动蛋白、肌球蛋白组成[28]，由图6 所示，鹅肉纤维蛋白分子量主要集中在43 kDa 肌球蛋白（Actin）与在180 kDa 肌球蛋白辅助蛋白（肌球蛋白重链）的蛋白条带最明显。鹅肉的肌原纤维蛋白与Marker 谱图对比发现，其他腌制处理组的肌原纤维蛋白在72～180 kDa 处条带模糊弱化，超声联合滚揉腌制的蛋白条带在43 kDa 处条带出现明显的扩散现象，在26～43 kDa 处条带颜色最深，表明滚揉或超声腌制处理一定程度上加速鹅肉蛋白降解，生成小分子片段，可能是鹅肉肌细胞中的一些内源性蛋白酶在滚揉及超声波等外力的影响下释放，从而使肌原纤维蛋白的溶出及降解[8]。

图6 不同腌制方式处理鹅肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE 图谱Fig.6 SDS-PAGE map of goose myofibril protein treated by different pickling methods

3 结论

通过对扬州盐水鹅生坯鹅肉保水性和其肌原纤维蛋白相关指标变化的测定结果综合分析可知，5 个不同腌制处理组各项指标具有显著影响。超声联合滚揉腌制对鹅肉保水性有明显的改善，超声联合滚揉腌制鹅肉肌原纤维蛋白表面疏水性和羰基含量低于真空滚揉、加盐滚揉、超声腌制处理组，其总巯基含量最高，反映其蛋白氧化程度低。加盐滚揉腌制鹅肉肌原纤维蛋白的总巯基含量最低，羰基含量最高，表明蛋白氧化程度高。超声联合滚揉腌制的蛋白条带在43 kDa 处条带出现明显的扩散现象，在26～43 kDa处条带颜色最深表明蛋白发生降解。综上所述超声联合滚揉腌制是最佳腌制方法，能够增强盐水鹅生坯的保水性，同时也能有效降低蛋白质氧化的程度，一定程度上加速蛋白质降解从而改善鹅肉的嫩度，与微观结果一致。为盐水鹅生坯腌制方式的优化和工业化生产提供理论依据和数据支撑。因此，后期工作将集中完善超声联合滚揉腌制工艺参数，探索盐水鹅生坯工业化。