反向DNA-pulldown方法的建立

[摘 " 要] " 目的：建立反向DNA-pull down方法，验证目的蛋白与靶DNA的结合，为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段。方法：以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板，通过PCR扩增获得转录因子PU.1 -ETS结构域编码序列，通过酶切连接的方式连入表达质粒pET28a，转化至大肠杆菌BL21（DE3）诱导蛋白异源表达。以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR获得Ly96启动子序列。将异源表达的PU.1 ETS结合至Ni-NTA磁珠后，与靶DNA—Ly96启动子体外孵育，最终经蛋白酶K酶解、DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS体外结合Ly96启动子情况，评估反向DNA-pull down技术的可行性。结果：通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS复合物，通过PCR获得Ly96启动子序列，经反向DNA-pull down验证PU.1 ETS与Ly96启动子的相互结合作用。结论：以PU.1-ETS-Ly96启动子相互作用为例，证实反向DNA pull-down技术的可行性，为探究已知蛋白与靶DNA结合和疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案。

[关键词] " 蛋白-DNA结合；反向DNA-pull down方法；异源表达；PU.1转录因子

[中图分类号] " Q503 [文献标志码] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.003

Establishment of reverse DNA-pull down method

CHU Jiaqi1， WANG Xueming1， KOU Yanbo2， YAN Xiaoqing3

（1First Clinical College; 2Jiangsu Key Laboratory of Immunity and Metabolism; 3Laboratory of Emergency Medicine，

Xuzhou Medical University， Jiangsu 221004）

[Abstract] " Objective： To establish a reverse DNA-pull down method for verifying the binding of the target protein to the target DNA， providing a new approach for exploring the molecular mechanisms of disease development. Methods： The total cDNA of mouse bone marrow-derived macrophages was used as a template to amplify the coding sequence of the ETS domain of the transcription factor PU.1 by PCR. The ETS domain coding sequence was then ligated to the expression vector pET28a by enzymatic digestion， and then transformed into Escherichia coli BL21（DE3） for heterologous expression of the protein. The Ly96 promoter sequence was amplified with mouse genomic DNA as a template. The heterogeneously expressed PU.1 ETS complex was bound to the Ni-NTA beads， after which the beads-PU.1 ETS complex was incubated with the target DNA-Ly96 promoter in vitro. The PU.1 ETS-Ly96 promoter interaction was evaluated by agarose gel electrophoresis after proteinase K digestion and DNA extraction to verify the feasibility of reverse DNA-pull down. Results： The Ni-NTA beads-PU.1 ETS complex was obtained through heterologous expression and affinity purification. The Ly96 promoter sequence was amplified by PCR， and the interaction between PU.1 ETS and the Ly96 promoter was verified by reverse DNA-pull down. Conclusion： Taking the interaction of PU.1-ETS-Ly96 promoter as an example， the feasibility of reverse DNA-pull down technology is confirmed， which provides an alternative scheme with simple operation， low experimental conditions and low cost for exploring the molecular mechanism of binding of known protein to target DNA and disease development.

[Key words] " protein-DNA binding; reverse DNA-pull down assay; heterologous expression; PU.1 transcription factor

蛋白表达开始于编码基因的转录，转录起始的核心是蛋白（转录因子/辅转录因子或转录复合物）与目的DNA（启动子）的结合，该过程在细胞内受严格的调控。研究基因转录调控，特别是以转录因子为代表的蛋白与DNA结合机制是阐明蛋白表达调控方式的重要手段，也是明确疾病发生发展分子机制的有力依据。目前研究蛋白与DNA结合的经典方法较多，包括染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）、凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、双荧光素酶实验、酵母单杂交实验等。然而，这些方法往往操作较为复杂，而且或多或少存在着某些不足之处[1-7]。如ChIP实验不能排除转录因子通过结合其它辅/转录因子而与启动子结合，EMSA需要对目的DNA进行标记而增大实验成本，双荧光素酶实验稳定性和重复性欠佳，酵母单杂交实验需要特殊的宿主酵母和质粒系统等。因此，寻找研究蛋白与DNA结合的新方法具有重要意义。

本研究基于DNA-pull down实验基本原理[8]，以转录因子PU.1-ETS结构域-Lymphocyte antigen 96（Ly96）启动子为代表[9]，建立反向DNA-pull down方法，为探究蛋白与DNA直接结合提供新的策略。

1 " 材料与方法

1.1 " 材料 " 6周龄野生型C57BL/6小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），大肠杆菌感受态DH5α和BL21（DE3）、高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技术股份有限公司），逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司），Ni-NTA琼脂糖磁珠（Qiagen），Trizol、核酸内切酶NcoⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ及DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific），基因组提取试剂盒、切胶回收试剂盒和核酸纯化试剂盒（广州飞扬生物工程有限公司），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 " 方法

1.2.1 " 转录因子PU.1 ETS结构域编码基因克隆：无菌操作取野生型C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓，分离并诱导骨髓来源的巨噬细胞。收集细胞后提取总RNA，逆转录后获得总cDNA。以总cDNA为模板，PU.1 ETS-F（5′-CATGCCATGGGCCCTGGGCCAGG-

TCTTCTGCACGGG-3′）和PU.1 ETS-R（5-′CCCAA

GCTTCCCACGGCCCAGCACCTCGCC-3′）为引物进行PCR扩增。将PCR产物经切胶回收获得纯化的PU.1 ETS结构域编码序列。

1.2.2 " PU.1 ETS结构域表达质粒的构建：将pET28a空质粒和1.2.1中纯化的PU.1 ETS结构域编码序列用NcoⅠ和HindⅢ双酶切后，通过凝胶回收获得线性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS编码序列。将线性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS编码序列按照摩尔比1 ∶ 7的比例混合，并用DNA连接酶连接，连接产物以热激法转化至大肠杆菌DH5α中。过夜培养后挑取转化子，经菌液PCR和酶切验证正确的重组质粒进行测序，测序无误的重组质粒用于后续蛋白表达。

1.2.3 " PU.1 ETS结构域异源表达：将1.2.2中测序无误的重组质粒和pET28a空质粒（对照）分别通过热激法转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性转化子验证无误后，接种至LB培养基，置于旋转摇床，37 ℃，220 r/min，直至生长至对数期中后期。取该菌液按照1 ∶ 50比例转接至新鲜LB培养基中，继续培养2～3 h后，向培养基中添加终浓度1 mmol/L IPTG，将培养条件改为20 ℃，100 r/min，过夜培养后收取菌体。将菌体用PBS洗涤3次后进行超声破碎，收集上清，采用SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。

1.2.4 " PU.1 ETS结构域蛋白纯化：将1.2.3所得的上清与平衡好的Ni-NTA琼脂糖磁珠按照说明书推荐的比例混匀，置于旋转摇床，4 ℃，80 r/min，孵育4 h。然后4 ℃下3 000 r/min离心5 min，收集磁珠，5 mmol/L咪唑洗涤1次，PBS洗涤3次，得到对照磁珠和纯化的结合有PU.1 ETS结构域的Ni-NTA琼脂糖磁珠。

1.2.5 " Ly96启动子序列克隆：收集1.2.1中骨髓来源的巨噬细胞，提取总DNA，以该总DNA为模板，PLy96-F（5′-TAATTGTCTCCCTGAAAATGTGC-3′）和PLy96-R（R：5′-TAAACTCGCCAGGAAGACCAT-3′）为引物进行PCR扩增，获取Ly96启动子区，切胶回收后获得纯化的Ly96启动子。

1.2.6 " 反向DNA-pull down实验：将等量的1.2.4所得的Ni-NTA琼脂糖磁珠分别与1 μg Ly96启动子混匀，置于旋转摇床4 ℃，80 r/min孵育2 h，离心收集珠子，PBS洗涤5遍后用150 μL PBS重悬磁珠，加入终浓度40 μg/mL蛋白酶K，45 ℃，酶解2 h。利用DNA纯化试剂盒回收酶解释放的Ly96启动子，最终通过琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS结合Ly96启动子情况。利用Image J软件对电泳条带进行灰度分析。

1.3 " 统计学处理 " 采用Graph Pad Prism 9.0软件进行数据分析。计量资料以■±s表示，两组间比较采用t检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 " 结 " " "果

2.1 " PU.1-ETS结构域表达质粒的构建 " 以骨髓来源的巨噬细胞总cDNA为模板，PCR扩增PU.1-ETS编码区（图1A）。目的产物经切胶回收纯化后，由NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切，连入表达质粒pET28a，得到重组质粒pET28a-PU.1-ETS。pET28a-PU.1-ETS分别经NcoⅠ/HindⅢ和KpnⅠ/XhoⅠ酶切验证产生条带约为5 300 bp/320 bp和5 400 bp/190 bp（图1B）。测序无误后用于后续实验。

2.2 " PU.1-EST结构域的异源表达和纯化 " 将上述测序无误的pET28a-PU.1-ETS和对照空载体pET28通过热激法分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取转化子经菌液PCR验证正确后，取1号（对照菌株，携带pET28a）和4号（重组蛋白表达菌株，携带pET28a-PU.1-ETS）转化子用于后续诱导重组蛋白表达（图2A）。转化子经IPTG诱导后，收集菌体进行超声破碎，将超声破碎后的全菌体、沉淀和上清样本进行SDS-PAGE电泳，发现pET28a-PU.1-ETS转化子沉淀和上清中均存在大量疑似目的蛋白（图2B）。为进一步确定该蛋白是否是PU.1-ETS-His重组蛋白，我们利用His-Tag抗体进行Western bolt检测，重组蛋白理论分子量为13.92 kD，Western blot结果显示在接近15 kD处检测到His Tag信号，表明该蛋白确实为PU.1-ETS-His重组蛋白（图2C）。

2.3 " PU.1-ETS与Ly96启动子反向DNA-pull down技术 " 已有文献报道PU.1能识别并结合淋巴细胞抗原96（lymphocyte antigen 96，Ly96）编码基因启动子，调控Ly96转录。因此，本研究以PU.1-ETS-Ly96启动子为例验证反向DNA-pull down技术的可行性。将2.2中菌体破碎上清中重组蛋白、Ni-NTA琼脂糖珠、纯化的Ly96启动子按图 3A所示流程进行操作，最终通过琼脂糖凝胶电泳检测PU.1-ETS体外结合Ly96启动子情况。结果显示，虽然空珠子有一定的DNA结合背景，但与空珠子相比，结合PU.1 ETS的珠子明显能吸附更多的Ly96启动子区DNA，表明Ni-NTA-PU.1-ETS在体外能有效结合Ly96启动子（图3B-E），证明反向DNA-pull down技术可用于体外蛋白与核酸结合的检测。

3 " 讨 " " "论

机体的健康稳态实际上是各个组织器官处于适应当前环境的状态表现，随着环境的改变，机体需要相应改变以适应新环境，保持健康的稳态。然而，有些情况下机体并不能对环境作出很好的应答，往往导致疾病产生。机体拥有适应不同环境并保持健康稳态的潜力，是在不同环境下基因选择性调控表达的结果。因此，探究机体应对环境保持健康稳态的机制，本质上是要研究在对应环境下功能基因转录调控和功能蛋白活性调节的机制。对比健康和疾病状态下蛋白表达调控机制的改变，并基于此开发相应的药物以纠正错误的蛋白表达模式或将是预防和治疗相关疾病的有效策略。本研究基于DNA-pull down的基本原理，提供一种反向DNA-pull down技术，用于体外探究蛋白（转录因子/辅转录因子）与DNA（启动子）结合情况，为解析疾病发生发展的分子机制提供新的可选手段。

传统DNA-pull down技术利用生物素标记启动子，将标记的启动子与靶转录因子/辅转录因子或核蛋白提取物孵育，然后通过链霉亲和素偶联的珠子捕获启动子-转录因子/辅转录因子复合物，最终通过Western blot检测靶转录因子/辅转录因子是否存在于沉淀物中，以此来证明启动子与转录因子/辅转录因子的结合[10]。该技术以已知启动子来钓取靶蛋白，很多时候研究者可能想要探究已知转录因子/辅转录因子的靶DNA，这种情况下DNA-pull down技术则显得捉襟见肘。为解决这一问题，本研究基于DNA-pull down技术基本原理，尝试利用已知蛋白来反向钓取靶DNA。将目的蛋白进行异源表达后结合于偶联对应结合物的磁珠上，随后以磁珠-目的蛋白复合物与靶DNA进行孵育，收集复合物并用蛋白酶将蛋白裂解释放钓取到的DNA，最终通过简单的琼脂糖凝胶电泳即可明确目的蛋白与靶DNA的结合情况。根据该方法的原理，若结合DNA文库和测序技术，还可进一步拓宽其应用，以探究目的蛋白能结合的未知DNA。

反向DNA-pull down技术不需要ChIP那样繁杂的操作步骤和特定抗体，不需要如EMSA技术标记探针，也没有酵母单杂交技术所必备的特殊酵母菌种、载体和培养体系。相对而言，反向DNA-pull down技术操作更为简单，对实验条件要求更低。当然，反向DNA-pull down技术也有缺点，如只能做到体外实验验证，而不能实时胞内验证；需要对目的蛋白进行异源表达，某些特殊蛋白未必能顺利完成异源表达；尽管诸多转录因子在体外可直接与启动子结合[11-12]，然而某些转录因子与启动子的结合依赖转录因子的翻译后修饰，如最常见的磷酸化等，本技术中转录因子来源于大肠杆菌异源表达，所得到的重组转录因子未必能够在大肠杆菌胞内获得有效的磷酸化修饰，因此反向DNA-pull down技术对这类依赖翻译后修饰而结合启动子的转录因子适用性有限。

此外，本研究发现空磁珠似乎有一定的DNA非特异性吸附现象（图3C，Ctrl组），若目的蛋白与靶DNA结合较弱，这种非特异性吸附所带来的背景信号很可能会干扰最终结果的判断。为解决这一问题，我们推测在磁珠-目的蛋白复合物与靶DNA孵育之前增加一步“封闭”步骤是一种可行的方案，即在磁珠-目的蛋白复合物与靶DNA孵育前加入无关DNA占据非特异性吸附位点，以最大程度降低后续靶DNA与磁珠-目的蛋白复合物的非特异性结合。但高效封闭非特异性结合位点的DNA长度和序列还在试验探索阶段。

综上所述，本研究以PU.1 ETS结构域-Ly96启动子为代表，建立反向DNA-pull down技术，为探究已知蛋白与靶DNA结合，探究疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案。

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[收稿日期] 2024-09-20

（本文编辑 " 王晓蕴）