提高玉米秸秆饲料化品质的食用菌筛选

黄泰富， 于洪文，3， 黄利春， 韩雪容，2

（1.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130000；2.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130000；3.中国科学院东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130000；4.兴安盟农牧科学研究所，内蒙古 乌兰浩特 137400）

我国作为一个农业生产大国， 农作物生物质副产物秸秆年产量近9 亿t （石祖梁等，2019）。2022 年全国农作物秸秆中玉米秸秆占比40.27%，但因其纤维素等难以被消化，其中的养分吸收利用率低，动物采食率较低，适口性差，只能作为动物的劣质粗饲料使用（李岫峰等，2022）。研究发现，食用菌有较强降解木质素的能力，且食用菌发酵不存在明显的安全问题 （尹珺伊等，2022； 丛立新，2014）。 在实际的食用菌栽培中杏鲍菇、 平菇和金针菇等多种常见食用菌菌糠可直接作为饲料或饲料添加剂（冯雪彬等，2021）。王雨琼等（2021）选用3 株分别为粉褶侧耳，糙皮侧耳和漏斗状侧耳的侧耳属白腐菌发酵饲料， 发现其能够有效改善发酵青稞秸秆的营养品质， 提高秸秆的利用效率。 综上所述，食用菌具有分解稻草、玉米等秸秆中木质纤维素的能力， 同时在其自身生长发育过程中可产生多糖、 蛋白质和脂肪酸等多种营养成分， 作为秸秆饲料化营养配方改良用真菌前景广阔。 然而直接将食用菌作为秸秆等生物质的添加菌剂发酵培养的研究较少， 缺乏相关食用菌用作提高玉米秸秆饲料品质的基础数据。

本研究拟对经粗筛降解酶系酶活较高， 且生长速率快的8 株食用菌使用ITS 条形码进行鉴定，再以玉米秸秆为唯一碳源作为培养料，通过比较该8 株食用菌对玉米秸秆中木质纤维素的降解率，对比粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷等含量，并采用扫描电镜能谱仪观察玉米秸秆结构的微观形态学，筛选出能高效降解玉米秸秆木质纤维素，同时能提高饲料化玉米秸秆营养价值的食用菌菌株，为高效利用玉米秸秆提供参考和基础数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试菌种： 分别编号为S1 ～S8的8 株食用菌由吉林农业大学提供。 玉米秸秆在吉林省长春市长春新区周边玉米地获得。

1.2 培养基 PDA 固体培养基 （刘红菊等，2018）：马铃薯去皮切小块200 g，煮沸30 min 过滤，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，去离子水定容至1 L，pH 自然，115 ℃高压灭菌30 min。 秸秆培养料配方：玉米秸秆粉（40 目）99.9%，多菌灵0.1%。

1.3 试剂及仪器 仪器：Synergy HIM 全功能微孔检测仪（美国Biotek 公司）；5430R 台式冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；SKGL-1200 管式炉（中国中科院上海光学精密机械研究所）；BSA224S-CW 分析天平（德国Sartorius 公司）；连续流动分析仪SAN++（荷兰Skalar）；5PrimeG/02基因扩增仪（比比科技有限公司）；IT-500 扫描电镜能谱仪 （日本JEOL 株式会社）；Vario MACRO cube 元素分析仪（德国Elementar 公司）。

试剂： 生工SK8259 Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒、 琼脂糖、TAE、TaqDNA 聚合酶、通用引物ITS1 及ITS4、5×PCR Buffer、dNTP 和DNA Ladder Mix maker 购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1．4 试验方法

1.4.1 8 种食用菌菌株培养 将8 种食用菌菌株（S1 ～S8）分别接种在PDA 固体培养基中，于摇床27 ℃恒温培养7 d。

1.4.2 菌种基因组DNA 提取方法 待PDA 培养基上长满菌丝后， 用镊子分别挑取8 种食用菌菌丝20 mg， 采用上海生工SK8259 Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒提取各菌株的DNA。

1.4.3 8 株菌种ITS 条形码的PCR 扩增与测序用真菌通用引物ITS1/ITS4（由上海生物工程有限公司合成）进行PCR 扩增。 ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3’。

PCR 反应体系（25 μL）：基因组DNA 0.5 μL，5×PCR Buffer（含MgCl2）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，F Primer 0.5 μL，R Primer 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，最后加ddH2O 补至总体积为25 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共36 个循环，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

在凝胶成像系统中观察经琼脂糖凝胶电泳后的PCR 产物，用小刀切下8 条编号为S1 ～S8，长度为600 ～700 bp 的条带， 采用Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的PCR产物，于上海生工生物工程有限公司测序。

1.4.4 8 株菌株分子系统发育树构建 将经公司测序后扩增的8 条ITS 序列输入NCBI 数据库，经BLAST 比对，选取与鉴定菌种相似度在99%以上序列，用MEGA5.0 构建系统发育树，系统发育分析采用MEGA 5.0 中的邻近相邻法（NJ）构建、分析。各分支的置信度经bootstrap 1000 次循环检验各分支的系统学意义与可靠性。

1.4.5 8 株菌种与玉米秸秆共培养 将PDA 上培养的S1 ～S8 菌每组取三个相同菌块， 分别接种在过40 目筛， 经121 ℃、30 min 蒸汽高压处理后， 含有1.5 L 玉米秸秆培养料的2 L 体积烧杯中，空白试验组为不接种食用菌的秸秆培养料。 在27 ℃，培养28 d 后，将每个试验组的降解后玉米秸秆培养料全部取出，均匀混合，放于50 ℃烘箱干燥4 h，研磨过40 目筛。每个试验组收集100 g 样品供后续试验使用。

1.4.6 培养料中纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素含量的测定 采用Van Soest（Tian 等，2017）法测定纤维素、半纤维素、木质素含量。

1.4.7 经8 株菌株分解的玉米秸秆扫描电镜分析每个试验组取样品质量1.0000 g， 同组试验的三个样品均匀混合，重新标号为a ～i。9 组样品用研钵研磨成粉末状，用牙签挑取少许处理后样品，在铜台上用导电胶粘好后放入离子镀膜仪上喷镀黄金，再用IT-500 扫描电镜能谱仪，在真空条件下观察拍照。

1.4.8 经侧耳属真菌处理后的玉米秸秆粗脂肪含量检测 采用索氏抽提法（Huijun 等，2022）测定培养料中粗脂肪含量。

1.4.9 经8 株菌株处理后的玉米秸秆元素含量检测 全氮测定方法：LY/T1269-1999 森林植物与枯枝落叶层全氮的测定。 准确称取磨细的样品0.3000 g 于三角瓶中，加1.8 g 催化剂（硒粉：硫酸铜：硫酸钾=1:10:100），加4 mL 浓硫酸，于电热板上消煮至溶液清亮即可，取下冷却后转入100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀待测。 待测液用连续流动化学分析仪（SKALAR SAN++）测定。

全N/（mg/kg）=测值×100/样重。

钙元素测定方法：LY/T1270-1999 电感耦合等离子体发射光谱（ICPS-7500）ICP-AES 法。 称取风干磨碎的样品0.5 g 于三角瓶中，加5 mL 浓HNO3，2 mL HClO4， 于电热板上消煮至溶液变成透明， 有少量白烟。 取下冷却， 加2.5 mL 10%HNO3，转入50 mL 容量瓶中，用去离子水定容，摇匀待测，同时做空白试验。待测液用电感耦合等离子体发射光谱（ICPS-7500） 或电感耦合等离子体质谱（NeXion350D）测定。

钙/（mg/kg）=（测值-空白）×50/样重。

植物全磷采用LY/T1270-1999 连续流动分析仪（SAN++）测定。 准确称取粉碎的样品0.3000 g于三角瓶中，加5 mL HNO3，2 mL HClO4，于电热板上消煮至透明，取下冷却，转入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀待测。 待测液用连续流动化学分析仪（SKALAR SAN++）测定。

全磷/（mg/kg）=测值×100/样重。

计算培养料粗蛋白质含量； 以上每个处理设3 次重复。

1.5 数据统计分析 采用Excel 软件和SPSS 20.0 软件进行数据统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 基于ITS 系统发育树的8 种菌株分类 8 个获得的ITS 序列测序结果在GenBank 中进行对比后，得到同源性较高菌株的ITS 序列。同时下载16 个具有代表性菌株序列与本试验所测的8 个菌株ITS 序列用MEGA5 软件采用邻近相邻法构建系统发育树，结果见图1。

图1 S1 ～S8 食用菌及其参考菌株ITS 序列的系统发育树

由图1 可知， 菌株S1、S5、S6 和S7 分别与Hypsizygus marmoreus（KU836544.1，MK966519.1，JX046017.1，JX046031.1） 同源性为 100% 、99.82%、100%和100%，以上菌株被鉴定为斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）。 菌株S2 与Pleurotus pulmonarius（MN244439.2）同源性为100%，被鉴定为肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）。菌株S3 与Stropharia rugosoannulat（MN622796.1）同源性为100%，被鉴定为大球盖菇（Stropharia rugosoannulat）。 菌株S4 与Pleurotus ostreatus（MN244441.2）同源性为100%，被鉴定为糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）。菌 株 S8 与Pleurotus eryngii（MH517524.1）同源性为100%，被鉴定为刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）。

2.2 8 株菌株与玉米秸秆共培养后的木质纤维素含量及营养成分变化

2.2.1 玉米秸秆中酸性洗涤木质素、纤维素、半纤维素含量 在接种了8 株食用菌28 d 后，玉米秸秆纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素和营养成分含量变化见表1，与不接种食用菌的对照组相比，秸秆培养料中的纤维素、 半纤维素和酸性洗涤木质素显著降低。8 株菌对纤维素降解中，S4 号菌株降解效果最好达到了48.4%， 其次是S7 号菌株，达27.35%。 对半纤维素降解中，S1 号菌株降解效果最好达到了62.85%， 其次是S5 号菌株，达60.15%。 对酸性洗涤木质素降解中，S4 号菌株降解效果最好达到了71.2%， 其次是S8 号菌株，达53.79%。 综合比较玉米秸秆各组降解率，糙皮侧耳的S4 菌株降解秸秆能力最强。

表1 食用菌对秸秆木质纤维素含量及营养成分的影响 %

2.2.2 培养料中营养成分含量 由表1 可知，在接种了8 株食用菌28 d 后，和不接种食用菌的空白对照组相比， 秸秆培养料中的营养元素均有明显提升。 粗蛋白质含量，S2 号菌株提升效果最好，提升了145%，其次是S8 号和S4 号菌株，粗蛋白质含量提升了111%和110%。 粗脂肪含量，S1 号菌株提升效果最好，提升了495%，其次是S2 号菌株，粗脂肪含量提升了476%。 钙含量，S2 号菌株提升效果最好， 提升了82%， 其次是S4 号菌株， 提升了76%。 磷含量，S4 号菌株提升效果最好，磷含量提升了100%，其次是S2 号菌株，磷含量提升了92%。

2.3 与8 株食用菌菌株共培养后玉米秸秆的微观结构变化 在玉米秸秆培养料接种食用菌28 d后， 采用扫描电镜观察玉米秸秆结构的微观形态学变化（图2）。 图2a 为玉米秸秆，纤维组成部分排列十分清晰，结构紧密，表面较为光滑。图2b ～图2i 分别对应S1～S8 号食用菌与玉米秸秆共培养后的扫描电镜， 均观察到秸秆结构受到不同程度破坏的微观形貌，其中S3、S6 试验组（图2d、图2g）中能观察到秸秆结构严重受损，秸秆相互交错且界限模糊，S4、S8（图2e、图2i）中能观察到秸秆暴露出中间层的木质纤维素骨架。

图2 S1 ～S8 对玉米秸秆的结构影响

3 讨论

目前已有研究表明， 饲料复合酶添加剂比单一酶添加剂发酵效果好， 但是复合菌制剂对发酵条件要求高，工艺繁琐，生产成本高，还可能存在拮抗和抑制的情况（李国祥等，2022）。食用菌通过分泌各种降解酶降解玉米秸秆各组分， 且降解效果优于复合酶添加剂（司徒成等，2022）。本研究中鉴定为糙皮侧耳的S4 菌株降解秸秆能力最强，Wan 等（2010）研究中白腐真菌Ceriporiopsis subvermispora降解玉米秸秆的木质素降解率为31.59%，对纤维素的降解率低于6%（18d）。 甄静等（2017）研究中Trametes hirsutaXYG422 在玉米秸秆中培养60 d 后，木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别为83.54%、50.65%和19.53%。该菌在培养28 d 后对玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素降解率可达48.40%、48.89%和71.2%。 通过扫描电镜能谱仪观察玉米秸秆微观层面降解，SEM 结果显示，食用菌降解后的玉米秸秆帚化严重，可见其结晶度明显降低，与郭晓威等（2017）研究结果一致， 可以证明食用菌能明显降低玉米秸秆的结晶度，提高适口性。粗蛋白质含量是衡量饲料品质的重要指标。 本试验结果表明，接种S2 菌株发酵28 d 饲料粗蛋白质含量可达12.48%，相比未接种食用菌粗蛋白质含量提升了145%。 对比秸秆氨化，微贮50 d，饲料中粗蛋白质含量为8.89%和5.67%， 相对只提升了70.31%和8.6%。（杨勤等，2015）。 而Pleurotus ostreatus F6 处理秸秆30 d 后粗蛋白质含量提升了151%（Bhuvnesh等，2011），本研究结果与之接近。同时食用菌中含有丰富的氨基酸、多糖、多肽、皂甙和多种微量元素，可以通过调节畜牧肠道微生物群，发挥抗菌、增强免疫力作用（郭远等，2022；刘启燕等，2019；袁建国，2010）。

4 结论

综上所述，食用菌发酵玉米秸秆是可行的，且不同菌种效果不一。 本研究证实糙皮侧耳菌是发酵饲用玉米秸秆的优势菌株， 该菌株具有较高的木质素降解能力，可改善玉米饲料的适口性，同时能显著提高饲料粗蛋白质等营养元素含量。 糙皮侧耳有作为玉米秸秆饲料改良菌的极大潜力。