大理牛街热泉来源嗜热纤维素酶基因的克隆、异源表达及其酶学性质研究

饶孟迪， 李文孟， 李 蕾， 普孝英， 阿周存， 尹以瑞

（大理大学农学与生物科学学院，云南 大理 671003）

纤维素酶是一类糖苷水解酶， 用于降解纤维素生成单糖或低聚糖，在生物乙醇、造纸、纺织、动物饲料、制药、服装等行业（邓立康等，2022；陈燕勤等，2004）利用纤维素酶分解植物纤维素（陈伟钊，2018），是一种储量较大的绿色可再生资源。在自然界中，许多生物都能产生纤维素酶，其中微生物来源的纤维素酶运用最为广泛 （何芳芳等，2020）。 在实际生产中，纤维素的降解大多在高温环境下进行， 因此对纤维素酶的热稳定性要求较高。因此，挖掘新的嗜热纤维素酶成为纤维素开发利用的研究热点。 胡惠仁等（2020）以真菌里氏木霉来源的纤维素酶做发酵所用的酶， 以纸浆为发酵碳源，通过深层液体发酵的方式，来降低打浆能耗，在造纸行业起到了促进作用。

然而，由于真菌来源的酶热稳定性较差，温度超过55 ℃时迅速失活，限制了其应用范围（Tenkanen 等，1992）。 嗜热纤维素酶因能在高温下长时间保持较高活性而备受关注， 如Aspergillus sp.DLCS-F18 所产纤维素酶最适温度为65 ℃，在70 ℃半衰期为80 min， 这预示着该酶可能在木质纤维素水解和动物饲料生产中发挥潜在利用价值（尹以瑞等，2021）， 热泉和地热环境作为典型的高温环境，则是许多嗜热酶的重要来源。

本研究以云南大理牛街温泉底泥为材料，进行宏基因组测序后，获得一个新的纤维素酶基因，命名为njcel6 ，对其进行克隆、异源表达和酶学性质研究，为其在食品、饲料和纤维素乙醇发酵等方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 热泉底泥样品采自云南省大理白族自治州洱源县牛街温泉（99°2'57"E，26°3'36"N）。热泉水表面温度为52 ℃左右，pH 为7.4，样品被快速冷冻于液氮罐，用于实验室宏基因组DNA 提取。表达载体使用pET-28a （+），E.coli DH5α 和E.coli BL21 分别用于功能基因的克隆和表达。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA 提取和宏基因组测序 通过power soil Kit （MOBIO DNeasy PowerSoil Kit，USA）提取热泉样品总DNA， 送至杭州联川生物技术股份有限公司， 采用HiSeq 2500 高通量测序平台进行宏基因组测序，基于功能预测，从宏基因组数据库中分离出纤维素酶基因序列njcel6。 将该纤维素酶基因核苷酸序列提交到GenBank， 登录号为OP880883。

1.2.2 序列分析 使用BLASTx 和BLASTp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 分别对njcel6 的DNA 和氨基酸序列进行比对， 并通过SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 预测信号肽，利用EXPASY 工具（http：//web.expasy.org/protparam/）推导和分析氨基酸序列的一级结构，通过Clustal X（Thompson 等，1997）与密切相关的蛋白序列进行多次比对（从NCBI 数据库检索）。 使用MEGA 7 软件包（Kumar 等，2016），采用最大似然（ML）方法和泊松校正模型构建系统发育树。

1.2.3 纤维素酶基因的克隆和异源表达 对njcel6 基因进行密码子优化后，再进行基因合成，并克隆到pET28a（+）载体上，将验证成功的重组载体pET28a-njcel6 导入E.coli BL21（DE3）中进行纤维素酶（njcel6）的异源表达。 然后，将该菌株接种于含有50 μg/mL 卡那霉素的新鲜LB 液体培养基（pH 7.0）中，37 ℃、220 r/min 摇床中过夜培养，作为种子液。 以1%接种量，将种子液接种于含50 μg/mL 卡那霉素的200 mL LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养2 ～3 h 至OD600≈0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1 mmol，再转入30 ℃、180 r/min 培养过夜。

1.2.4 粗酶液的提取及酶活测定 在4 ℃下8000×g 离心10 min，收获菌体，将菌体重悬于含有50 mL PBS 缓冲液（pH 7.4）中，进行超声破碎（150 W；20 min） 后， 再次4 ℃下10000×g 离心20 min，取上清作为粗酶液用于酶学性质研究。取20 μL 粗酶液加入到80 μL 含有1%羧甲基纤维素钠（CMC）的缓冲液中，在最适条件下反应30 min，以葡萄糖为标准，通过3，5-二硝基水杨酸（DNS）法确定还原糖的量（Miller，1959）。最后，取150 μL样品置于96 孔板中， 使用酶标仪在波长540 nm处进行吸光值的测定， 所有酶学测定均设3 个试验组，1 个对照组。

1.2.5 不同温度和pH 对纤维素酶活性的影响在不同温度下（25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）将50 μL 粗酶液与250 μL CMC（pH 7）进行30 min 孵育，加入450 μL（DNS）终止反应，沸水浴10 min 冷却后，使用酶标仪在540 nm 检测酶活（Miller，1959）。在最适反应温度下使用pH 3 ～10 的缓冲液（pH 3 ～8 为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，8 ～10 为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液） 检测不同pH 对粗酶液中纤维素酶活性的影响。

1.2.6 不同pH 和温度对粗酶稳定性的影响 将100 μL 粗酶液加入200 μL 缓冲液（pH 3、4、5、6、7、8、9 和10）中，于4 ℃下分别孵育12 h 和24 h后，在标准条件下测定其残留活性。以相同体积蒸馏水稀释的粗酶液为阳性对照（100%），在3 个温度（45、50、55 ℃）下培养不同的时间（0、30、60、90、120 min）后，测其残余活性，以未处理（0 min）粗酶液为阳性对照（100%）。

1.2.7 不同金属离子和抑制剂对纤维素酶活力的影响为测定金属离子和抑制剂对纤维素酶的影响，在标准的反应体系中分别加入11 种不同的金属离子（K+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Al3+）至终浓度为1 mmol 和10 mmol。不同抑制剂EDTA、SDS、PMSF 和DTT 至终浓度为0.1%和1%。 使用标准条件下，无添加剂的反应混合物作为阳性对照（100%）。

2 结果

2.1 序列分析 本研究从云南大理牛街温泉底泥宏基因组数据中，预测到一个GH5 家族的纤维素酶基因（GenBanK 登录号：OP880883），大小为1701 bp，命名为njcel6。基于氨基酸序列在NCBI Blastx 比对结果，njcel6 分别与Bryobacteraceae 菌株来源内切纤维素酶GIU77643.1 和GIU75612.1表现出95.20% 和72.88%的相似性。如图1 所示，利用NCBI 数据库中收集与njcel6 相似性较高的同源性序列构建系统进化树，结果显示，njcel6 与Bryobacterales 来源纤维素酶聚在一支， 因此，牛街热泉宏基因组来源的njcel6 属于Bryobacterales来源纤维素酶。

图1 基于njcel6 氨基酸序列同源性构建的系统进化树

2.2 SDS-PAGE 电泳分析 经SDS-PAGE 电泳分析可得， 诱导后重组子E.coli BL21 （DE3）-pET28a-njcel6 在61 kDa 处有较为明显的差异条带，结果如图2 所示，与理论预测的蛋白分子量基本一致，说明其为重组的目的蛋白条带。

图2 SDS-PAGE 胶图分析重组njcel6 纤维素酶

2.3 纤维素酶njcel6 的最适反应温度和pH 纤维素酶njcel6 粗酶液最适反应温度为50 ℃（图3A），最适pH 为5.0（图3B）。 纤维素酶njcel6 在温度50 ～65 ℃表现出95%以上的相对活性，在pH 5.5 ～6.0 表现出超过80%的相对活性， 表明该纤维素酶njcel6 系嗜热、耐酸纤维素酶。

图3 温度（A）和pH（B）对纤维素酶njcel6 活性的影响

2.4 纤维素酶njcel6 的稳定性 如图4A 所示，纤维素酶njcel6 粗酶液在45、50 ℃和55 ℃下进行孵育2 h，整体相对酶活保持在80%以上。在45 ℃下孵育2 h，其活性被激活，具有120%左右的相对活性；在最适温度50 ℃下孵育2 h，保持100%的相对活性；在55 ℃下孵育2 h，仍保持80%的相对活性。这说明该酶具有较强的热稳定性。此外，在最适反应温度下， 纤维素酶在pH 3 ～10 分别反应12 h 和24 h， 整体相对酶活保持在75%以上，24 h 处理后仍有80%以上的活性， 表明该纤维素酶具有较强的耐酸碱能力（图4B）。

图4 温度（A）和pH（B）对纤维素酶njcel6 稳定性的影响

2.5 不同抑制剂和金属离子对纤维素酶活力的影响 如图5 所示， 纤维素酶njcel6 粗酶液在4种抑制剂EDTA、SDS、PSMF 和DTT 浓度分别为0.1%（图5A）和1%（图5B）浓度的表现，其中DTT和PSMF 在0.1%、1%两种浓度下仍保留90%以上相对酶活；EDTA 保留了80%以上的相对酶活，而SDS 在两种浓度下只保留20%左右的相对酶活，对酶活力的抑制作用最为明显。 这说明EDTA、PSMF、DTT 抑制剂对酶的抑制作用不大，但在使用njcel6 过程中要避免SDS 的存在。

图5 不同抑制剂对纤维素酶活性影响

金属离子浓度为1 mmol（图6A）和10 mmol（图6B） 时，K+、Mg2+、Fe3+、Ni2+和Co2+等11 种测试金属离子对酶活力均无明显的抑制作用。 在离子浓度为1 mmol 时，Co2+、Mn2+和Al3+对酶活起促进作用， 相对活性在110%以上； 在离子浓度为10 mmol 时，Mg2+、Ca2+对酶活起到较为明显的促进作用，相对活性保持在140%以上。

图6 不同金属离子对纤维素酶活性影响

3 讨论

纤维素是地球上存在较为广泛的可再生资源，有效的利用纤维素资源，不仅可以减缓化石燃料造成的环境污染，还能缓解能源危机（冯雁等，2011）。目前通过微生物发酵可将各种生物质转化为生物乙醇， 其可以单独或与汽油混配制成乙醇汽油作为汽车燃料， 该工艺生产技术已经相当成熟，但生产成本较高，发展受到制约。 因为在生物乙醇发酵生产中起关键作用的是酶制剂价格，所以通过在高温下增加酶的活性，减少酶的剂量，从而减少酶的成本已被认为是一种可行的方法。 耐热酶具有更高的稳定性， 能减少水解所需酶的数量， 减少反应时间（Karnaouri 等，2019；Yang 等，2018）。 与来自中温菌的酶相比，耐热酶可以提高反应速率（Ajeje 等，2021），故可有效降低成本。

本研究中纤维素酶其反应的最适温度和最适pH 分别为50 ℃和5.0， 且在pH 4.5 ～7 有超出90%的相对活性，50 ℃孵育120 min， 仍保持100%相对活性。 巨大芽孢杆菌XT2 所产纤维素酶最适温度和最适pH 分别为50 ℃和6.0，K+对纤维素酶具有激活作用，Mg2+、Ca2+和Mn2+对酶活具有抑制作用（赵龙妹等，2021）。贝莱斯茅孢杆菌XH-4 来源的纤维素酶，最适温度和最适pH 分别为50 ℃和6.0， 金属离子Ag+对纤维素酶活性促进作用最强，Ca2+、Fe3+、K+对其活性有抑制作用（孙会刚等，2021）。根据以上研究可以得知，这些纤维素酶与本研究最适温度和最适pH 相似， 但在稳定性和耐金属离子方面njcel6 具有更强的金属离子耐受性和热稳定性。 这预示njcel6 纤维素酶在生物工程和食品行业有光明应用前景。

4 结论

本研究从大理牛街热泉富集物中获得一个重组耐热的纤维素酶基因（njcel6），在大肠杆菌中成功进行异源表达，njcel6 最适反应温度及pH 分别为50 ℃和5.0，55 ℃孵育2 h 仍保持80%以上相对活性，在pH 3 ～10 缓冲液中孵育24 h，仍能保持80%以上相对活性， 试验测试的11 种金属离子， 对酶活力均无明显的抑制作用， 抑制剂SDS存在明显抑制作用。 说明该纤维素酶是一种耐高温耐酸环境耐金属离子，pH 范围广泛的酶， 在饲料及食品加工生产中有很大的应用潜力。 综上所述，纤维素酶njcel6 可为后续纤维素酶在食品、饲料和纤维素乙醇等方面的运用提供参考。