副溶血性弧菌引起食源性疾病暴发事件调查与病原特征分析

李 荣,陈家良,王 洋,杨红霞*,商永超,孙珊珊,张文军

(1山西省阳泉市疾病预防控制中心疾病检验科,阳泉 045000;2中国疾病预防控制中心;3山西省疾病预防控制中心;*通讯作者,E-mail：bevy119@126.com)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一种革兰阴性嗜盐菌,广泛存在于海水和海产品中,能够导致急性胃肠炎甚至败血症等,是一种重要的食源性病原菌[1]。阳泉地区近年来检测出的副溶血性弧菌株,主要来自于食品中的贝类和鱼类。近些年来,我国流行菌株的优势血清型多为O3：K6、O4：KUT等[2-5],多数携带毒力基因tdh。自2020年以来,我国开始出现O10：K4血清型菌株,并在全国流行并成为优势血清型[6]。本文针对副溶血性弧菌引起食源性暴发事件进行流行病学及病原特征分析,分析暴发时间、发生场所及发生事件原因,找出关键防控点,为食源性疾病的防控和临床用药提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 2022年8月13日接到阳泉市郊区疾病预防控制中心报告,辖区医院从8月13日5∶00—6∶00时,陆续接诊25例有腹泻、腹痛、恶心、呕吐等消化道症状的患者,患者均为P煤业公司职工,发病前均在该公司食堂进餐,患者临床检查提示为细菌性感染,初步怀疑为一起食源性疾病暴发事件。

1.1.2 实验室培养基与试剂 磺胺增菌液、3%氯化钠碱性蛋白胨水、木糖赖氨酸脱氧胆盐培养基、哥伦比亚培养基、麦康凯琼脂培养基均购自北京路桥技术股份有限公司,沙门氏菌显色培养基、弧菌显色培养基均购自上海欣中生物工程有限公司,梅里埃API20E肠杆菌科鉴定试剂盒、微量生化鉴定管均购自北京路桥技术股份有限公司,副溶血性弧菌tlh/tdh/trh基因核酸检测试剂盒、细菌核酸提取试剂盒均购自江苏硕世生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 病例均为P煤业公司职工,发病前均在大食堂就餐。发病人群年龄最大59岁,最小25岁;男性24例(厨师1例),女性1例。

1.2.2 食品加工环节卫生调查 通过食品卫生学调查,发现消毒不到位,部分餐具未在保洁柜内存放,冷藏柜内生熟食品混放。切配食材用案板3块,生熟不分,且靠近清洗池。

1.2.3 样本采集和实验室检测 现场采集6份食品样品、4份饮用水样品、8份环境样品、25份患者便标本,结合病例的临床表现和流行病学特征,根据《食品安全事故流行病学调查技术指南》(2012年版)、《2022年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》和《2022年国家食源性疾病监测工作手册》,确定检测项目为：沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠杆菌、副溶血性弧菌和变形杆菌。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析 按照副溶血性弧菌PFGE分子分型的快速标准实验室规程,步骤如下：副溶血性弧菌在哥伦比亚平板上培养,制备菌悬液浓度为4.5麦氏单位以及包埋胶块,细胞用蛋白酶进行裂解,清洗胶块,胶块内的DNA使用NotⅠ限制性内切酶进行酶切,首选内切酶NotⅠ的电泳参数为脉冲时间10～35 s,电泳时间19 h,胶块进行染色30 min,Gel Doc2000凝胶成像仪读取电泳图谱,BN软件对PFGE图谱进行分析校准。

1.2.5 基因组测序和分析 使用细菌全基因组核酸提取试剂盒(江苏硕世生物科技股份有限公司)提取分离菌株的DNA进行细菌全基因组测序。使用二代测序质量控制软件FastQC和生信软件Trimmomatic(测序数据质控)对下机原始数据进行质量评估,使用软件SPAdes(基因组组装软件)、GapFiller(基因组组装软件)和ArrayVision(基因芯片综合分析软件)对质控后的数据进行拼接和序列矫正。用BLAST将拼接好的序列与病原菌的毒性因子(virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)数据库和综合抗生素抗药性数据库(the comprehensive antibio-tic resistance database,CARD)进行比对得到耐药基因和毒力因子的注释结果。用快速全基因组相似度估计软件FastANI比对序列间的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI),使用二代重测序数据分析的一款软件GATK检测变异位点,使用基于最大似然法构建进化树的软件FastTree构建基于核心基因SNP的系统发育树。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

25例患者的主要表现为腹泻、腹痛、恶心、呕吐,临床症状和体征分布见表1。

首发病例于2022年8月12日22∶00发病,末例病例于8月13日8∶00发病。中位发病时间为8月13日2∶00,随后病例逐渐下降。流行病学曲线显示为点源暴露模式,发病时间自8月13日0∶00起快速进入高峰期,持续到8∶00明显下降,首末病例发病时间间隔10 h,发病高峰期持续8 h(见图1)。副溶血性弧菌引起的食物中毒潜伏期为2～40 h,多为14～20 h,25例患者全部进食午餐,结合发病曲线为单峰点源暴露模式,推断可疑餐次为12日午餐。发病者潜伏期最短10 h,最长20 h,首末病例发病时间间隔10 h。

图1 P煤业公司发生的一起食源性疾病暴发事件病例发病时间分布Figure 1 Onset time distribution of a food-borne disease outbreak in P Coal Company

2.2 实验室培养结果

现场采集的6份食品样品、4份饮用水样品、8份环境样品中未检出可疑菌落,25份患者便标本中检测出11株副溶血性弧菌。

2.3 生化鉴定结果

病例检测出的11株可疑菌群经初步生化检验氧化酶、葡萄糖、甘露醇、赖氨酸脱羧酶反应为阳性,蔗糖、乳糖、硫化氢反应为阴性。嗜盐性试验：副溶血性弧菌在0%和10%氯化钠胰胨水中不生长或微弱生长,在6%和8%氯化钠胰胨水中生长旺盛,符合副溶血性弧菌生化反应特点。

2.4 毒力基因检测结果

8株副溶血性弧菌分离株毒力基因为tlh和tdh,1株副溶血性弧菌分离株毒力基因为tlh、trh和tdh,1株副溶血性弧菌分离株毒力基因为tlh和trh,1株副溶血性弧菌分离株毒力基因为tlh。

2.5 脉冲场凝胶电泳检测结果

检测11株副溶血性弧菌菌株得到了11条脉冲场指纹图谱,将副溶血性弧菌NotⅠ酶切电泳图像导入BN软件,构建系统发生树,进行聚类分析,分析的结果显示：11株副溶血性弧菌共形成5个分支,菌株之间的指纹图谱相似度在64.06%～92.00%之间(见图2)。

图2 11株副溶血性弧菌PFGE分型图谱聚类分析Figure 2 Cluster analysis of PFGE genotypes of 11 strains of Vibrio parahaemolyticus

2.6 药敏实验结果

药敏结果显示11株副溶血性弧菌对氯霉素、萘啶酸、四环素、美罗培南、氨苄西林、阿米卡星、厄他培南、替加环素、头孢噻肟、头孢他啶和环丙沙星均敏感,对多黏菌素E中度敏感,均无耐药表型。

2.7 菌株基因组测序分析结果

对11株副溶血性弧菌核心基因组构建系统发育树,结果显示除编号SX22YQ0377、SX22YQ0378、SX22YQ0379外,其余菌株聚集成簇(SNP<3,见图3)。使用resfinder数据库鉴定耐药基因,11株菌均只含有blaCARB耐药基因,且未检测到耐药质粒。使用副溶血性弧菌血清型数据库共鉴定到3种血清型即O10：K4、O4：K63和O5：unknown(见表2)。

图3 副溶血性弧菌系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of Vibrio parahaemolyticus

表2 11株副溶血性弧菌基因组特征

3 讨论

副溶血性弧菌食物中毒事件均发生在夏季7—9月,原因为炎热夏季海产品储运过程无法保持低温致使副溶血性弧菌污染食堂环境,疾控检验难以第一时间进入食物中毒食堂场所,而行政部门已经先期通知食堂等待接受检验,事发食堂第一时间已经处理食堂环境致使环境检验往往效果不佳。虽然实验室未在海鲜冻品检出副溶血性弧菌,但不能排除海产品在冷冻储存前的交叉性污染。不论其用于生食或熟食,都可能通过案板、刀或厨师的手在厨房中造成交叉污染,这是不容小觑的食物中毒的源头,所以我们要特别注意海鲜产品的表面污染问题。本次食源性中毒事件中,25例患者分离出11株分离菌株。现场采集6份食品样品,采集的是冰柜中的冻存海鲜和患者食用的食品样品,副溶血性弧菌不适于低温生存,在低温情况下易死亡,低温条件下容易进入不可培养状态,难以保藏。饮用水和环境未检出副溶血性弧菌,可见饮用水未被副溶血性弧菌污染。环境样品采集时,环境已经进行消毒清洁处理,未能检测到可疑菌落。流行病学监测45人在食堂进食,其中有25人出现临床腹泻症状,采集标本,检测出11株副溶血性弧菌。该食堂储存食物时生熟不分,副溶血性弧菌机会性繁殖在合适的含盐食物中也可以增殖,进而引起该起事件发生。依据病例的临床症状、现场流行病学和卫生学调查以及实验室检测结果,参照《2022年国家食源性疾病监测工作手册》、《2022年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》和《副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则》[7],综合分析该事件为一起由多种血清型副溶血性弧菌污染了食品而导致的食源性疾病暴发事件。

本事件中,PFGE聚类图谱分析相似性,在92%～100%之间,定义为亲缘关系较为相近的聚类,条带完全相同的菌株为同一带型,条带之间差异较为大的为不同带型。检测菌株的条带相近系数在83%～92%。SX22YQ0377和SX22YQ0379之间条带相似为89.47%,SX22YQ0378和SX22YQ0376之间条带相似为83.45%,剩余7株菌株之间相似度为92%。11株副溶血性弧菌分为5种带型,有明显的多态性,说明菌株进化来源于不同的克隆系别。各个菌株本身也存在不同程度的变异,说明在菌株进化过程中受到环境、温度等一系列外部环境的影响,引起了基因的变异。这些突变在进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)时表现出来,从而形成了不同的条带。还有可能是冰柜中存放多种类型海鲜,携带的副溶血性弧菌型别不同。25例患者分离出的11株分离菌株血清型为O10：K4、O4：K63、O5：unknown,SX22YQ0377的血清型为O10：K4,SX22YQ0379的血清型为O5：unknown,由此可以判断副溶血性弧菌血清学分型和PFGE之间没有特殊相关性,即不同血清型的菌株也可以聚集成簇,且带型一致或相似度很高。菌株基因组测序结果显示9株菌株聚集成簇(SNP<3),SX22YQ0377的血清型与聚集成簇的菌株血清型均为O10：K4,并含有blaCARB-22耐药基因,可以判断副溶血性弧菌血清学分型和耐药基因与基因组测序之间无特殊相关性,即相同血清型的菌株以及存在相同的耐药基因不会聚集成簇。菌株的毒力基因结果显示毒力基因和基因组测序之间有着特殊的相关性,携带相同毒力基因菌株核心基因组构建系统发育树可以聚集成簇,并具有相同的ST型,属于同一克隆群,并且其毒力、耐药基因和药敏表型相同。

全基因组测序技术可以获得菌株中的所有遗传信息,结合生物信息技术和数据库的比对,可以快速准确地完成溯源分析[8]。两种检测技术结合流行病学调查,在食源性疾病暴发流行的过程中,可以起到鉴定、分析、预警等作用。有必要加大执法力度,加强对餐饮行业的卫生监督管理,同时进行食品卫生宣传教育,杜绝一些安全隐患,最大限度地减少食物中毒的发生[9]。