LINC00324对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及分子机制

马诗淇,丁 毅,李 敏,王梦慈,张思宇,冯树梅*

(1新疆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,新疆地方病分子生物学重点实验室,乌鲁木齐 830011;2南京医科大学基础医学院病理学教研室;3新疆第二医学院基础医学院解剖学教研室;*通讯作者,E-mail：87391167@qq.com)

皮肤黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤,具有很强的侵袭性和转移性[1]。与皮肤癌相比,其具有较高的死亡率(65%～70%)[2]和较低的生存期(中位生存期仅为9个月)[3]。据统计,我国恶性黑色素瘤患者5年的生存率不足10%。因此明确皮肤黑色素瘤的发病机制,有利于早期发现并预防患者从良性痣向恶性肿瘤的转变,降低黑色素瘤患者的死亡率。

大多数长链非编码RNA(lncRNAs)是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA POI Ⅱ)从独立启动子转录而来的长度大于200 bp的非编码转录本[4]。与编码蛋白质相比,lncRNAs参与几乎所有细胞的功能。自噬是肿瘤细胞用来调节细胞压力和新陈代谢的一种分解代谢机制,其完成依赖于正常溶酶体功能[5],抑制或激活自噬可破坏肿瘤细胞[6]。本课题组前期通过生物信息学分析得到与自噬相关的lncRNAs,其中LINC00324可作为抑癌基因发挥作用,并通过KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(gene ontology)数据库分析推测黑色素瘤的潜在机制可能与自噬相关[7]。并且有研究表明,Bcl-2能够通过多种途径参与细胞自噬,例如,YAP(Yes-associated protein)通过上调Bcl-2抑制自噬从而促进人结直肠癌的发展[8]。目前在黑色素瘤中与自噬相关lncRNAs的研究鲜有报道,因此本研究以LINC00324为研究对象,探索LINC00324是否通过Bcl-2介导自噬抑制从而进一步影响黑色素瘤细胞的增殖、转移和侵袭。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人源性皮肤恶性黑色素瘤细胞系(SK-MEL-2)购于武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液购买于美国Hyclone公司;胎牛血清购于美国Gibco公司;过表达载体由上海吉凯基因科技有限公司构建,siRNA由广州锐博生物技术有限公司构建;LipofectamineTM3000购于美国Thermo Fisher公司;LC3B(L7543)购于美国Sigma公司;p62(ab91526)、Bcl-2(ab196495)购于美国Abcam公司;GAPDH(6004-1-lg)购于美国ProteintechGroup公司;反转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒购于北京全式金生物科技有限公司;Matrigel胶购于美国Corning公司。

1.2 生物信息学分析

在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)数据库中输入目的基因LINC00324,分析工具栏中选择“Boxplot”,肿瘤类型选择黑色素瘤,log2FC临界值定为1,P值定为0.01,分析其在黑色素瘤与癌旁组织中的表达情况。其次,在分析工具栏中选择“Survival plot”,分组方式选择“Median”,分析LINC00324在黑色素瘤患者中的生存相关性,评估其在黑色素瘤中的预后价值。

1.3 细胞转染及分组

使用LipofectamineTM3000转染试剂,将LINC00324过表达载体和siRNA转染至铺有SK-MEL-2细胞的6孔板或96孔板中,并标记为过表达阴性对照组(NC组)、过表达组(OE组)、沉默阴性对照组(si-NC组)和沉默组(si-LINC00324组)。将转染细胞置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h,收集细胞,采用qRT-PCR检测LINC00324的转染效率以及Beclin1、LC3A/B、Bcl-2的mRNA表达水平,CCK-8检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,Transwell实验检测细胞侵袭,Western blot检测LC3B、p62、Bcl-2的蛋白表达水平。

1.4 qRT-PCR检测LINC00324以及Beclin1、LC3A/B、Bcl-2的mRNA表达

采用Trizol法从细胞中提取总RNA,利用反转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,然后采用PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒对cDNA进行扩增。β-actin为内参基因进行归一化处理。反应条件∶94 ℃预变性30 s;94 ℃变性5 s,退火延伸60 ℃ 30 s,40个循环。

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力

在96孔板中转染LINC00324过表达载体和siRNA,培养24 h后,去除旧培养基,每孔加入100 μL新鲜完全培养基以及10 μL CCK-8试剂,在37 ℃含有5% CO2恒温箱中培养2 h,使用酶标仪检测在450 nm波长处的光密度(OD)值。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

将细胞接种于6孔板中(3×105个/孔),当细胞汇合度达到95%左右时,使用200 μL无菌枪头垂直划线,PBS清洗3次并在无血清培养基中孵育,倒置显微镜下观察0 h和24 h细胞的迁移情况并拍照。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将处理后的细胞分别接种于Matrigel基质胶处理和未处理的Transwell小室上室中(8×104个/孔),下室加入700 μL含有10%胎牛血清的完全培养基,于37 ℃、5% CO2恒温箱中培养36 h,加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色15 min,使用倒置显微镜观察拍照。

1.8 Western blot检测LC3B、p62、Bcl-2的蛋白表达

将细胞裂解液RIPA和蛋白酶抑制剂混合物加入转染24 h后的细胞中裂解30 min,提取细胞总蛋白,BCA法定量总蛋白。采用SDS-PAGE分离蛋白,转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,一抗4 ℃摇床孵育过夜,抗体及稀释比例为：LC3B(1∶2 000)、p62(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)。二抗(1∶10 000)室温孵育1 h,使用ECL试剂盒发光显影。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 黑色素瘤组织中LINC00324的表达及与患者预后的关系

GEPIA数据库分析显示,与癌旁组织相比,LINC00324在黑色素瘤组织中表达下调(P<0.01,见图1A)。生存分析结果显示,LINC00324低表达患者具有更短的生存时间(见图1B)。

图1 LINC00324在黑色素瘤组织中的表达和生存分析Figure 1 Expression of LINC00324 in melanoma tissues and survival analysis

2.2 LINC00324在黑色素瘤细胞中成功转染

qRT-PCR检测结果显示,与NC组相比,OE组SK-MEL-2细胞中LINC00324显著上调(P<0.001,见图2A);与si-NC组相比,si-LINC00324组细胞中LINC00324下调(P<0.01,见图2B),认为转染成功。

注：与NC组相比,***P<0.001;与si-NC组相比,##P<0.01。图2 黑色素瘤细胞SK-MEL-2中LINC00324的转染效率Figure 2 Transfection efficacy of LINC00324 in melanoma cell SK-MEL-2

2.3 LINC00324抑制SK-MEL-2细胞的增殖和迁移能力

划痕实验结果显示,与NC组相比,OE组细胞迁移能力明显受到限制(P<0.001);与si-NC组相比,si-LINC00324组细胞迁移能力显著上调(P<0.01)。CCK-8实验结果显示,与NC组相比,OE组细胞增殖能力降低(P<0.001);与si-NC组相比,si-LINC00324组细胞增殖能力升高(P<0.01,见图3)。

2.4 LINC00324抑制肿瘤细胞的侵袭能力

Transwell实验结果显示,与NC组相比,OE组细胞侵袭能力被抑制(P<0.01,见图4)。

2.5 LINC00324抑制黑色素瘤细胞的自噬能力

qRT-PCR结果显示,在OE组细胞中,Beclin1、LC3A/B显著下调(P<0.01,见图5)。Western blot检测结果显示,与NC组相比,OE组细胞中,LC3BⅡ的表达下调,p62的表达上调(均P<0.05);与si-NC组相比,si-LINC00324组细胞中LC3BⅡ上调,p62下调(均P<0.05,见图5)。以上结果提示,在黑色素瘤细胞中,LINC00324抑制细胞自噬。

注：与NC组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与si-NC组相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。图5 LINC00324对黑色素瘤细胞SK-MEL-2自噬能力的影响Figure 5 Effect of overexpression of LINC00324 on autophagy ability in SK-MEL-2 cells

2.6 Bcl-2介导LINC00324诱导的自噬抑制

qRT-PCR和Western blot检测结果显示,与NC组相比,OE组Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与si-NC组相比,si-LINC00324组Bcl-2的mRNA以及蛋白表达水平显著下调(P<0.01,见图6)。以上结果提示,Bcl-2可能介导了LINC00324诱导的自噬抑制。

注：与NC组相比,**P<0.01;与si-NC组相比,##P<0.01,###P<0.001。图6 过表达和沉默LINC00324对SK-MEL-2细胞中Bcl-2表达的影响Figure 6 Effect of overexpression and siRNA of LINC00324 on Bcl-2 expression in SK-MEL-2 cells

3 讨论

lncRNAs功能的获得和丧失可以影响细胞发育和疾病发生[9]。LINC00324是一个2082 bp的基因间非编码RNA,位于人染色体17p13.1上,其被发现在多个肿瘤内异常表达,并与肿瘤的增殖、迁移、侵袭、凋亡和预后较差有关[10]。例如,在肺腺癌组织中LINC00324高表达,其异常表达能够促进肺腺癌增殖并抑制其凋亡[11]。Sharma等[12]研究发现,LINC00324在食管鳞状细胞癌中显著上调,并确定其可以通过靶向miR-493-5p激活MAPK信号通路从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。目前,LINC00324在黑色素瘤中的研究鲜有报道,其作用及具体机制尚不明确。因此,有必要进一步探讨LINC00324在黑色素瘤中的表达以及对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制,旨在为黑色素瘤患者提供新的诊疗思路。

本研究通过数据库分析显示,LINC00324在黑色素瘤细胞和组织中低表达,且低表达与患者预后较差有关,进一步通过转染LINC00324过表达载体和siRNA,利用CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验检测,证明其可以抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上结果提示LINC00324可能作为黑色素瘤治疗中新的分子靶点。

自噬是一种在进化上高度保守、用于降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程[5]。自噬通过抑制良性肿瘤的发展和促进恶性肿瘤的进一步恶化在癌症中发挥双重作用[13]。在癌症早期,自噬在维持细胞动态平衡阶段抑制肿瘤生长,随着肿瘤发展,癌细胞表现出高度自噬依赖性,自噬对细胞具有促进作用[6]。当自噬发生时,胞浆型LC3-Ⅰ会被酶解掉一小段多肽,转变为膜型LC3-Ⅱ;p62作为泛素化结合蛋白,与泛素化的蛋白质结合后,与自噬小体内的LC3-Ⅲ结合形成复合物并一同在自噬溶酶体内降解。因此LC3-Ⅱ增多、p62减少常常被认为是自噬流通畅的标志[14]。本研究通过qRT-PCR和Western blot实验检测,结果显示,过表达LINC00324后自噬相关的mRNA水平和蛋白水平均显著降低,提示自噬被抑制。并且,还有研究表明,抗凋亡基因Bcl-2是与自噬相关的细胞死亡的重要调节因子,且Bcl-2的过表达不会促进细胞增殖但阻止细胞死亡[15]。例如,Zhang等[16]研究显示,Bcl-2相互作用蛋白3(BNIP3)在缺氧条件下可以通过抑制Bcl-2与BECN1结合来激活自噬从而促进乳腺癌肿瘤发生;Liu等[17]研究显示,在宫颈癌中,过表达MiRNA-211可以通过抑制Bcl-2诱导细胞自噬,并进一步抑制宫颈癌细胞的增殖。本研究中,过表达LINC00324后Bcl-2显著上调,沉默后则相反。因此推测Bcl-2可能介导了黑色素瘤细胞内的自噬抑制,并进一步影响黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述,本研究初步证实了LINC00324在黑色素瘤细胞中低表达且与患者预后相关,过表达LINC00324可以抑制黑色素瘤细胞的自噬水平以及增殖、迁移和侵袭能力,同时,研究显示抗凋亡基因Bcl-2上调,推测其参与了该过程。但是本研究仍存在局限性,缺少对自噬和Bcl-2的回复实验以及体内实验。因此,后续会进一步通过自噬激活剂以及基因敲除Bcl-2更深层次的对本研究论点进行验证,为黑色素瘤的治疗提供新的视角和靶点。