基于网络药理学和分子对接探索脑栓通胶囊治疗脑梗死的潜在机制研究

周 红 雷 杰 程 欢

武汉市第一医院 湖北武汉 430000

脑梗死是一种常见的脑血管疾病,是仅次于心血管疾病的人类第二大死亡原因,也是导致残疾的主要原因[1]。据统计,每年新发的脑梗死患者多达1 500万左右[2],这给社会经济带来了沉重的负担[3]。对个体而言,脑梗死常见的致残性后遗症,如运动功能损伤可能会导致患者的神经心理功能障碍,严重影响个体的生活质量[4]。目前,除了重组组织型纤溶酶原激活剂治疗和血管内血栓切除术外,临床尚无其他有效治疗手段[5]。而已有治疗手段又存在治疗窗口短、疗效低、出血风险大等局限性,仅有限的患者可以接受有效治疗。

脑栓通胶囊是据刘河间“心火独亢”理论组方,由蒲黄、赤芍、郁金、天麻和漏芦5味中药组合而成,具有活血通络、祛风化痰之效,临床常被用于治疗风痰瘀血痹阻脉络引起的中风一病。循证医学证据证实[6],脑栓通胶囊可以增加血脂联素,减少动脉粥样硬化斑块面积,减轻神经功能缺损,改善神经功能,在脑梗死治疗方面具有一定疗效。尽管临床应用较为广泛,脑栓通胶囊发挥疗效的深层次机制尚待明确。因此,本研究拟借助网络药理学手段进一步探讨脑栓通胶囊在脑梗死治疗过程中的潜在机制,以期为其未来研究及临床应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 脑栓通胶囊活性成分及靶点的获取与筛选

在TCMSP数据库[7]中分别以蒲黄、赤芍、郁金和漏芦为关键词检索候选化学成分及对应的蛋白靶标。由于TCMSP数据库缺少天麻相关数据,故联合ETCM数据库[8]补充检索天麻的化学成分及靶点。口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%且类药性(Drug Like index, DL)≥0.18的化合物可被视作可经人体吸收而对机体产生活性的潜在药物[9]。根据OB≥30%且DL≥0.18的原则筛选获取的化学成分及所对应的靶点,并将所有药物靶点进行合并整理,剔除重复的药物靶点,得到总药物靶点。将蛋白种属设置为“homo sapiens(Human)”,利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)标准化处理药物活性成分的蛋白靶标,获取靶标对应的标准基因名。

1.2 脑梗死相关靶点的获取

以“ischemic stroke”和“cerebral infarction”为关键词,分别检索以下5个数据库:GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)和DrugBank(https://www.drugbank.ca/),从而获取与脑梗死相关的疾病靶点基因。其次,利用InteractiVenn工具[10]将各个数据检索到的靶点进行去重、合并,获取脑梗死相关靶点合集。

1.3 构建“活性成分-疾病靶点”网络图

将所有药物靶点和所有疾病靶点分别导入InteractiVenn平台,获得药物和疾病的交集靶点,即为脑栓通胶囊治疗脑梗死的潜在作用靶点。下一步,将药物关键活性成分、交集靶点等数据导入Cytoscape 3.8.0软件,构建“活性成分-疾病靶点”网络。网络中,以不同颜色和形状的节点表示药物成分或靶点信息,节点间的连线表明两者间可能存在相互作用关系。

1.4 蛋白质相互作用网络分析

将交集靶点导入STRING数据库[11],物种选择为“Homo sapiens”,设定相互作用阈值置信度>0.9,并隐藏无互作关系的靶点,获取蛋白与蛋白相互作用信息,并将其导入Cytoscape 3.8.0 软件构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。接着,利用CytoNCA插件[12]对PPI网络进行拓扑分析。拓扑分析内容包括介度中心性(betweenness centrality, BC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、度中心性(degree dentrality, DC)、特征向量中心性(Eigenvector Centrality, EC)、局部连通中心性(Local Average Connectivity Centrality, LAC)和网络中心性(network centrality, NC)共6个指标。筛选标准:首先,计算出所有节点BC值的中位数,再筛选出BC值大于该中位数的“核心”节点。同理依次筛选出其余5个指标大于所有节点中位数的节点,最后得到的节点即为关键节点。最后,将所得关键节点再次导入Cytoscape软件进行子网络分析,得到核心靶点间新的PPI网络。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

利用R语言clusterProfiler包[13]和pathview包[14]等工具对脑栓通胶囊与脑梗死的交集靶点进行基因本体论(Gene Ontology, GO)[15-16]和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析,并以气泡图形式可视化前30条GO条目和KEGG信号通路。

1.6 分子对接验证

为了验证筛选出的脑栓通胶囊治疗脑梗死潜在靶点的准确性,将“活性成分-疾病靶点”网络中所有的活性成分与PPI网络拓扑分析度值排名靠前的核心靶点进行分子对接。第一步,在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索药物活性成分,下载其2D分子结构,而后将其导入ChemBio3D软件转化为3D分子结构,并进行能量最小化优化,获得最稳定的分子构象,保存为mol2格式文件。第二步,从PDB数据库[17]下载靶点蛋白的晶体复合物,使用PyMOL软件[18]准备蛋白,删除靶蛋白的水分子和配体,输出为pdb格式文件。第三步,利用AutoDockTools软件给蛋白靶点添加非极性氢,输出为pdbqt文件,并生成对接位点空腔。最后,分别利用AutoDock Vina软件[19]和PyMOL软件进行分子对接及可视化。对接完成后,根据低能量和构象合理的原则选择最佳对接构象。

2 结果

2.1 脑栓通胶囊活性成分及靶点

以OB≥30%且DL≥0.18为条件筛选,最终得到脑栓通胶囊活性成分如下:赤芍14种、漏芦5种、蒲黄6种、郁金3种和天麻1种。去重后剩余活性成分23种(见表1)。根据活性成分的筛选结果预测作用靶点数目如下:赤芍102种、漏芦50种、蒲黄218种、郁金69种和天麻3种,去重后共注释得264个脑栓通胶囊的潜在作用靶点。

2.2 脑梗死疾病靶点

通过数据库检索获取的脑梗死相关靶点数量:Genecard数据库1 855个,OMIM数据库45个,PharmGkb数据库105个,TTD数据库82个,DrugBank数据库105个。合并去重后共得到脑梗死相关靶点2043个(图1)。

图1 各数据库脑梗死相关靶点数量

2.3 “活性成分-疾病靶点”网络

比较脑栓通胶囊潜在作用靶点与脑梗死相关靶点的异同,最终发现两者存在149种共同靶点。使用Cytoscape 3.8.0软件构建脑栓通胶囊治疗脑梗死的“活性成分-疾病靶点”网络(图2)。图2包括162个节点,349条边。浅蓝色圆角矩形代表潜在靶点,圆形代表化合物。其中,红色节点代表赤芍,黄色节点代表漏芦,绿色节点代表蒲黄,紫色节点代表郁金,蓝色节点代表天麻。

图2 活性成分-疾病靶点网络

2.4 PPI网络

将149个交集靶点信息导入STRING数据库进行分析,获取蛋白与蛋白相互作用信息,并将生成的数据导入Cytoscape软件生成PPI图。通过拓扑学分析筛选出关键核心靶点,将初次筛选出的41个靶点再次作拓扑学分析,最终筛选出核心靶点13个:JUN、MAPK8、TNF、IL6、TP53、RB1、MAPK3、IL1B、FOS、MAPK14、MAPK1、AKT1、NFKBIA(图3)。

图3 PPI网络节点拓扑筛选过程

2.5 GO功能分析

为了探讨脑栓通胶囊靶点的基因功能,利用R语言进行GO功能富集分析。结果共得到2744个GO条目。分别选取生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)前10的GO功能条目绘制气泡图(图4)。其中生物过程(BP)2473条,主要包括脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、氧化应激反应(response to oxidative stress)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)等方面;细胞组分(CC)84条,主要包括神经元胞体(neuronal cell body)、膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)和膜区(membrane region)等;分子功能(MF)187条,主要包括细胞因子活性(cytokine activity)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、血红素结合(heme binding)、肾上腺素能受体活性(adrenergic receptor activity)等方面。

2.6 KEGG通路富集分析

为了探讨脑栓通胶囊治疗脑梗死作用靶点可能涉及的通路,利用R语言进行KEGG通路富集分析。分析结果显示脑栓通胶囊可能通过以下信号通路发挥治疗作用:血流剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、细胞凋亡(Apoptosis)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)和NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等。选取KEGG富集结果前30条信号通路绘制气泡图(图5)。

图5 脑栓通胶囊对脑梗死作用靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.7 分子对接

通过PPI网络拓扑分析得到核心靶点13个,对应的“活性成分-疾病靶点”网络包括关键核心活性成分9个:β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、芍药甙(paeoniflorin)、黄芩素(baicalein)、柚皮素(naringenin)、异鼠李素(isorhamnetin)、花生四烯酸(arachidonic acid)和鞣花酸(ellagic acid),与核心靶点进行分子对接。一般认为结合能小于-4.25 kcal/mol提示配体与受体有一定的结合活性,小于-5.0 kcal/mol有较好的结合活性,小于-7.0 kcal/mol有强烈的结合活性[20]。分子对接结果显示,网络中关键活性成分与核心靶点结合能均小于-5.0 kcal/mol,说明活性成分与靶蛋白能形成稳定的结合(表2)。其中与槲皮素结合较好的靶点达到9个,用Pymol软件将槲皮素与靶点蛋白对接结果可视化(图6)。

图6 槲皮素与靶点蛋白的分子对接(a: JUN;b: TNF;c: IL6;d: TP53;e: RB1;f: IL1B;g: MAPK1;h: AKT1;i: NFKBIA)

表2 活性成分与靶点蛋白结合能

3 讨论

脑梗死是指因局部供血障碍而引发脑组织缺氧、缺血性坏死的危重疾病,临床可见肢体麻木无力、言语障碍、头晕、黑朦、意识障碍等症,表现出发病急、病势重、治疗窗窄和致残率高等特点,严重时可危及生命[21]。大量流行病学证据表明,脑梗死的发生可归因于环境和生活方式等多种因素,包括高龄、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病以及遗传等因素[22-24]。脑梗死发病机制较为复杂,可通过一系列复杂的机制导致神经细胞死亡和大脑功。

本研究共鉴定槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、芍药甙、黄芩素、柚皮素、异鼠李素、花生四烯酸和鞣花酸等关键活性成分与脑梗死高度相关。分子对接发现,上述成分与“活性成分-疾病靶点”网络中对应的靶点蛋白具有较好的结合活性。槲皮素是天然药物成分中最常见、分布最广泛的黄酮醇类化合物之一,具有抑制氧化应激和抗神经炎症等作用[30]。实验研究表明,槲皮素对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有神经保护、抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡作用,这些作用与其通过降低蛋白酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性而保护ERK和Akt磷酸化有关[31]。研究表明,山奈酚治疗可减轻脑缺血大鼠的神经行为缺损,减少脑梗塞体积、神经元和轴突损伤以及胶质细胞的神经病理学反应,其机制可能是通过抑制STAT3和NF-κB的激活来减轻脑缺血再灌注损伤和神经炎症[32]。黄芩素可显著改善脑梗死伴随的神经功能缺损和脑水肿,其对脑缺血/再灌注的神经保护作用可能与其抑制LOX-1、COX-2、PGE2和NF-κB等炎症介质而发挥抗炎和抗氧化作用有关[33]。

本研究发现脑栓通胶囊可能通过施加抗炎、抗氧化应激和抗细胞凋亡等作用来治疗脑梗死,主要涉及的信号通路包括血流剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡和NF-κB信号通路等。基因集富集分析表明[34],肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路以及血流剪切应力和动脉粥样硬化与脑缺血再灌注损伤相关。相关研究显示,脑梗死患者的血管内皮细胞功能严重紊乱,形成大量内皮素,导致钙离子内流,出现氧自由基,影响星形胶质细胞、脑血流调节以及神经元功能调节,促进TNF-α、CRP等炎性因子的释放[35]。而脑栓通胶囊可能通过靶向抑制TNF-α的表达,缓解患者的神经炎症水平。众所周知,细胞凋亡对脑梗死患者神经元的功能非常重要[36]。Bcl-2家族在调节细胞凋亡中起着至关重要的作用,例如Bcl-2和Bax[37]。Bcl-2/Bax比值对调节细胞存活和死亡很重要[38]。脑栓通胶囊可能通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低促凋亡蛋白Bax表达,从而抑制神经元凋亡,保护受损脑组织。

综上,脑栓通胶囊中的槲皮素、山奈酚和黄芩素等多种成分协同作用于TNF、NFKBIA和JUN等关键靶点,调节TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡和NF-κB信号通路等通路,发挥抗炎、抗氧化应激和抗细胞凋亡等作用,从而达到治疗脑梗死的目的。虽然本研究由于条件所限未能进一步开展实验验证,但是,既往研究已经表明,继发于脑缺血后的神经炎症反应会抑制神经组织再生,是影响脑康复的重要因素。将来我们将进一步围绕脑栓通的抗炎作用机制展开实验研究,从实验层面验证上述结果的可靠性[39]。本研究结果可为脑栓通胶囊的深入研发和临床应用提供参考。当然,由于网络药理学本身方法学的局限性,本研究结果可能存在一定偏差,今后需进一步开展试验验证。