穗花杉双黄酮对人胃癌细胞株增殖、侵袭、迁移、粘附的影响及作用机制探讨※

张梅芳 石 建 吕 军 薛 刚△

(1.江苏省如皋市中医院药剂科,江苏 如皋 226500;2.江苏省如皋市中医院内科,江苏 如皋 226500)

胃癌不但是我国也是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,中老年人群是胃癌的主要发病群体,但随着人们生活环境、饮食习惯的变化,近年来胃癌的发生率呈年轻化趋势[1-3]。目前治疗胃癌的主要手段为手术结合术后化疗,但化疗后的毒副作用明显,大多数患者无法耐受。近年来,中医药在治疗胃癌方面疗效确切,尤其在减轻化疗毒副作用、改善患者生活质量方面效果显著[4-5]。卷柏科卷柏属江南卷柏,含有丰富的黄酮类成分,其中含量较大的主要为双黄酮类,穗花杉双黄酮(amentoflavone,AMF)就是从中提取的一种双黄酮类单体,研究表明AMF具有很好的抗癌活性[6],可抑制卵巢癌细胞迁移[7],促进肺腺癌细胞凋亡[8]等。我们前期研究也显示,AMF能有效抑制人胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡[9]。为进一步研究AMF的抗癌作用,本实验继续以人胃癌细胞为目标观察AMF对人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 药物及细胞株 AMF,分子式为C30H18O10,购自中国药品生物制品检定所,用二甲基亚砜(DMSO)溶解,4 ℃保存,临用前用完全培养基稀释成所需浓度;BGC-823人胃癌细胞株,购自中国中医科学院中药研究所。

1.1.2 试剂 1640培养液(含小牛血清、双抗)购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购买自Biosharp公司;基质胶Matrigel、纤维粘连蛋白(FN)胶购自美国BD公司;Transwell侵袭小室购自美国Millipore公司;蛋白质印迹法(Western blot)抗体：β-actin一抗购自美国Sigma公司,基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)一抗购自美国Cell Signaling公司,山羊抗鼠、抗兔二抗购自北京中杉生物技术公司,其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 MTT细胞增殖试验 将BGC-823人胃癌细胞接种于96孔板,每孔8×103,待细胞贴壁后,实验组分别加入含AMF浓度为400、200、100、50 μmol/L的1640培养液干预,另设含1‰DMSO的对照及不加任何药物的1640培养液对照,培养24 h后,向96孔板中每孔加入MTT染色,继续培育4 h,用酶标仪检测490 nm波长处吸光值,通过公式：(1-实验组/对照组)×100%,计算AMF对BGC-823人胃癌细胞增殖的抑制率,试验重复3次,取3次结果平均值,绘制成柱状图。

1.2.2 Transwell侵袭试验 将BGC-823人胃癌细胞接种于直径为10 cm培养皿,饥饿细胞24 h后,消化细胞,事先将Matrigel胶稀释(与去离子水1∶9),平铺于每个Transwell小室底部,随后将5×105/100 μL BGC-823人胃癌细胞接种于小室中,小室置于24孔板中,上室为含1%血清培养液,下室为含10%血清培养液,按照预设的不同浓度AMF(依次为400、200、100 μmol/L)给药,空白对照组不给药,24 h后结晶紫染色,取下Transwell小室基底膜,于倒置显微镜下(×400)拍照,分析各组差异。

1.2.3 细胞划痕试验 将BGC-823人胃癌细胞接种于24孔板,每孔1×106,放至孵箱,待细胞贴壁后,用枪头在每孔中划3道痕,洗掉不再贴壁的细胞,空白对照组不加任何药物,试验组分别加入含不同浓度AMF(依次为400、200、100 μmol/L)的,培养24 h后,弃上清,于倒置显微镜下(×100),拍照,分析各组差异。

1.2.4 细胞粘附试验 将BGC-823人胃癌细胞接种于直径为10 cm培养皿,按照预设的含不同浓度AMF(依次为400、200、100 μmol/L)的1640培养液培养,空白对照组1640培养液不加任何药物,24 h后消化细胞,离心,用原含药培养液重悬细胞沉淀,事先将FN胶稀释至浓度0.1 mg/mL,平铺于96孔板,随后96孔板中每孔接种1×105个细胞,每隔20 min吸弃原含药培养液,加入不含任何药物的1640培养液,至80 min时,吸弃每个孔中的培养液,继续培养4 h,MTT染色,将96孔板于酶标仪上测490 nm波长吸收值,所得数据进行分析差异。

1.2.5 Western bolt实验 采用Western bol法检测与侵袭、迁移、粘附相关的RECK、MMP-2、MMP-9蛋白及PI3K/Akt通路相关的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达情况。将BGC-823细胞接种于直径为10 cm培养皿,按照预设的含不同浓度AMF(依次为400、200、100 μmol/L)的1640培养液培养,空白对照组1640培养液不加任何药物,24 h后,提取各组浓度相关蛋白,随后用Western bolt法进行蛋白浓度测定,最后得出Western bolt条带。

2 结果

2.1 各组BGC-823细胞增殖抑制率比较 50、100、200、400 μmol/L浓度的AMF对BGC-823细胞增殖均有抑制作用,抑制率分别为(17.63±2.9)%、(38.16±3.8)%、(61.44±5.3)%、(83.71±4.2)%,与1‰DMSO组及空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),且随AMF浓度增加抑制率逐渐升高(P<0.05),呈现浓度依赖性关系。见图1。

图1 各组BGC-823细胞增殖抑制率比较*P<0.05

2.2 Transwell侵袭试验结果 镜下观察显示,空白对照组Transwell小室基底膜上细胞轮廓清晰、活力旺盛,而各试验组Transwell小室基底膜上细胞变圆、稀疏。与空白对照组相比,100、200、400 μmol/L浓度AMF组侵袭过去的细胞数目均明显低于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度的增加侵袭细胞数逐渐减少(P<0.05),呈现浓度依赖关系。见图2、表1。

表1 Transwell侵袭试验随机5个视野下的穿膜细胞数 个

图2 Transwell侵袭试验随机视野下穿膜细胞图(×400)

2.3 细胞划痕试验结果 与空白对照组相比,AMF 100、200、400 μmol/L浓度迁移至划痕区域内的BGC-823细胞数目均少于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度增加迁移细胞数目逐渐减少(P<0.05),呈浓度依赖关系。见图3。

注：两侧黑线内为迁移过去的细胞

2.4 细胞粘附试验结果 100、200、400 μmol/L浓度的AMF作用于BGC-823细胞20、40、60、80 min后,各浓度组在各时间点粘附于FN胶上的细胞数均低于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度的增加,细胞粘附抑制率越大,随着作用时间的增加,细胞粘附抑制率亦越大(P<0.05),呈浓度、时间依赖关系。见图4。

图4 细胞粘附试验结果

2.5 Western bolt实验

2.5.1 各组RECK、MMP-2及MMP-9蛋白表达比较 与空白对照组比较,AMF 100、200、400 μmol/L组RECK蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05),MMP-2及MMP-9蛋白表达量均低于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度的增加RECK蛋白表达量明显增高,MMP-2及MMP-9蛋白表达量明显降低(P<0.05),呈浓度依赖关系。见图5。

图5 各组RECK、MMP-2及MMP-9蛋白条带图

2.5.2 各组PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达比较 与空白对照组比较,AMF 100、200、400 μmol/L组的p-Akt及p-PI3K蛋白表达量均低于空白对照组(P<0.05),且随AMF浓度的增加表达量明显降低(P<0.05),呈浓度依赖关系。但各组间PI3K及Akt蛋白表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图6。

图6 各组PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白条带图

3 讨论

恶性肿瘤除了可以不受限制的增殖外,侵袭和迁移是其临床典型的特征,可导致肿瘤的转移扩散,严重威胁患者的生命健康。恶性肿瘤转移扩散的本质即是肿瘤细胞通过血液或淋巴管,脱离原发病灶,侵润周围靶器官,或迁移至远处正常组织中,形成新的肿瘤病灶,这是一个多因子参与的复杂过程[10]。MMP家族是一类蛋白水解酶,几乎可以降解细胞外基质内的任何一种成分,在肿瘤转移扩散中发挥着重要的作用[11-12]。MMP-2及MMP-9是MMP家族的主要成员,研究表明基底膜是上皮肿瘤细胞侵袭、迁移过程中的第一道屏障,其主要成分包括基底膜胶原、纤连蛋白、弹性蛋白,而MMP-2及MMP-9能够通过降解基质和基底膜的活性,增强肿瘤细胞的侵袭能力[13-15]。因此,MMP-2及MMP-9的表达情况可以反映出恶性肿瘤的侵袭转移能力,对于评估患者的预后具有重要意义。RECK是MMP的抑制剂,可以通过抑制MMP家族蛋白如MMP-2、MMP-9的表达而抑制恶性肿瘤的侵袭[16-17]。大量研究发现,在恶性肿瘤细胞株中,RECK蛋白一般低表达,但若通过一定手段使恶性肿瘤细胞中RECK表达增加时,相对应恶性肿瘤细胞中MMP-2、MMP-9的表达含量则会减低,肿瘤细胞的恶性转移性也随之降低[18]。

PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生发展过程中起着极其重要作用[19]。Akt是PI3K的下游效应分子,PI3K通过p-Akt来激活其生物学活性,激活后可影响多种与肿瘤细胞生成和转移相关基因的表达,如MMP家族蛋白,促进肿瘤细胞侵袭和转移[20-21]。因此,抑制PI3K/Akt信号通路活化,能有效抑制肿瘤进程,遏制其进一步发生侵袭、转移。

基于此,我们以PI3K/Akt信号通路为切入点,探索AMF能否抑制PI3K/Akt的磷酸化水平,并通过MTT细胞增殖试验、Transwell侵袭试验、细胞划痕试验及细胞粘附试验观察AMF对BGC-823人胃癌细胞增殖、侵袭、迁移、粘附能力的影响。MTT细胞增殖试验结果显示,不同浓度的AMF对BGC-823细胞增殖均有抑制作用,在AMF浓度为400 μmol/L时抑制能力最强。Transwell侵袭试验结果显示,各浓度AMF组Transwell侵袭小室中侵袭过去的细胞数目均明显少于空白对照组,在AMF浓度400 μmol/L时其抑制侵袭能力最强。细胞划痕试验结果显示,各浓度AMF组迁移到划痕区中的细胞数目均少于空白对照组,在AMF浓度400 μmol/L时迁移到划痕区的细胞数目最少。细胞粘附试验结果显示,AMF对BGC-823细胞的粘附抑制率随着时间、浓度的增加而增加,呈时间、浓度依赖关系。最后通过Western bolt实验观察AMF对RECK、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响,以及对PI3K、Akt蛋白表达与磷酸化的影响,结果显示不同浓度的AMF对BGC-823细胞内MMP-2及MMP-9蛋白表达均抑制作用,对RECK蛋白表达均有促进作用,且对PI3K及Akt蛋白的磷酸化过程有抑制作用,且均呈现浓度依赖性,在浓度为400 μmol/L时表现最佳。

综上所述,AMF能抑制BGC-823人胃癌细胞株的增殖、侵袭、迁移、粘附能力,其机制可能与促进RECK蛋白表达,下调MMP-2及MMP-9蛋白表达,并抑制PI3K及Akt蛋白磷酸化从而抑制PI3K/Akt信号通路表达有关。本试验局限在体外肿瘤细胞上,下一步我们将从体内动物实验出发,进一步验证AMF的抗肿瘤机制。