4种柑橘籽油脂肪酸组成及生物活性成分

杨华夏，曹雪丹，林玉丹，叶丽姿，汤莹琪，李佳*

（1.中国计量大学生命科学院，浙江杭州 310018；2.浙江省柑橘研究所，浙江台州 318026）

柑橘（Citrus）属于芸香科柑橘属（RutaceaeCitrus）植物，喜生长于环境湿润且温暖适宜的气候下，广泛种植于亚热带地区，在我国主要种植栽培的柑橘属植物包括柑类、橘类、橙类、柚类[1]。柑橘作为芸香科中种植面积最广的属类，在全世界的年产量超过了1.84 亿t[2]。随着经济的快速发展与人们生活水平的不断提高，柑橘类水果制作成的果汁饮品越来越受到消费者的青睐，众多柑橘类的水果被大量收获，加工成各式各样饮品的同时产生了果皮、籽等不可食用的加工副产物[3]。不可食用的部分或以动物饲料的方式处理，或直接当作生物废弃物丢弃，这不仅导致资源浪费，而且会对土壤以及环境造成潜在的危害[4]。研究发现柑橘类水果所产生的生物废弃物含有许多对人体健康有益的高附加值化合物，在预防和治疗相关疾病等领域具有重要意义[5]。其中柑橘籽被认为是油脂以及功能活性物质的重要来源，种子含油量为38.9%～58.5%[6]，高于大豆（18%～23%）、棉籽（18.84%～30.82%）、油茶籽（20%～35%）等油料。据报道，柑橘籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸，其中油酸和亚油酸含量较高，另外还含有柠檬苦素类、植物甾醇、生育酚、黄酮类、多酚类化合物等[7]。从生物学角度看，这些功能活性物质在抗氧化、刺激免疫系统、抗炎、抗癌、抑菌以及降低心血管疾病发生等方面具有重要的作用[8-9]。因此柑橘籽油具有开发功能性油脂或者食用型油脂的潜力。

柑橘产业是浙江省农业主导产业之一，浙江柑橘栽培历史悠久，至今大约已有2 400年历史，《橘录》作为世界上第一部公认的比较完整的柑橘专著就出自于浙江[10]。瓯柑（Citrusreticulatacv.Suavissima）在我国柑橘品种中占据重要地位，主产于浙江温州和丽水一带，温州民间流传着“端午瓯柑似羚羊”的说法，其果形大，环境适应性强，果肉口感独特[11]。椪柑（CitrusreticulataBlanco）属于芸香科柑橘属植物，是浙江省衢州市的特产，营养丰富、种植面积广、产量高、易剥皮、既可鲜食也可加工[12]。香橙[Citrusjunos（Sieb.）Tanaka]起源于我国长江中上游地区，目前衢州新发展的香橙基地种植的香橙果形大、耐受性强，深受果汁加工企业青睐[13]。胡柚（CitrusparadisiMacf.cv.huyou）属于芸香科柑橘属植物，产量高、适应性强，目前分布于浙江衢州各地，主产于常山县，是当地具有特色性的柑橘品种，具有产量高、营养物质含量丰富等特点[14]。

本文选用浙江本地生产的温州瓯柑籽、衢州椪柑籽、衢州香橙籽、常山胡柚籽作为原料，通过索氏提取法提取油脂，对脂肪酸组成、柠檬苦素类化合物和橙皮苷、柚皮苷的含量进行对比分析，探究4 种柑橘籽油脂肪酸和生物活性成分含量差异，以期为新植物油原料的研究与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

瓯柑籽：浙江百霖农业科技有限公司；椪柑籽、香橙籽、胡柚籽：浙江金明生物科技有限公司；正己烷（分析纯和色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、柠檬苦素标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）：杭州高晶精细化工有限公司；37 种混合脂肪酸甲酯标准品、诺米林标准品、奥巴叩酮标准品、橙皮苷标准品、柚皮苷标准品：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

800Y 高速多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；FA1004 电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HP-1515 恒温加热台：盐城汉邦电热机械有限公司；BCD-222KSA 冰箱：青岛海尔特种电器有限公司；DHG-9146A 鼓风恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；BSXT-02 索式提取装置：上海比朗仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅：浙江省赛德仪器设备有限公司；E-301 旋转蒸发仪：巩义市瑞德仪器有限公司；2010plus 气相色谱、LC-20AT 高效液相色谱：日本岛津公司；U3000 高效液相色谱仪：美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘籽预处理

将瓯柑籽、椪柑籽、香橙籽、胡柚籽置于清水中清洗数次，捞出待水分沥干后将其铺平放置于鼓风恒温干燥箱60 ℃条件下烘干，将预处理后的4 种不同柑橘籽置于高速多功能粉碎机进行粉碎处理，过40 目筛网，所得到的柑橘籽粉末置于鼓风恒温干燥箱80 ℃条件下降低其水分，放入干燥器中备用。

1.3.2 常规指标测定

水分的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的方法进行；灰分的测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的方法进行。

1.3.3 索氏提取法制备柑橘籽油

分别称量10 g 瓯柑籽、椪柑籽、香橙籽和胡柚籽粉末并用滤纸包裹好放置于索氏提取管，加入90 mL正己烷于提取瓶中，80 ℃的条件下提取8 h，将提取所得的样品溶液经旋转蒸发仪于40 ℃真空条件下旋蒸获得柑橘籽油，置于-20 ℃避光储存。

1.3.4 柑橘籽含油率计算

柑橘籽含油率计算公式如下。

式中：X为柑橘籽含油率，%；m0为不同柑橘籽粉末质量，g；m1为不同柑橘籽油质量，g。

1.3.5 柑橘籽油脂肪酸组成测定

甲酯化方法：柑橘籽油甲酯化采用GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》中的方法进行。

气相色谱条件：色谱柱为安捷伦DB-23 色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；氢火焰离子化检测器温度270 ℃；进样器温度250 ℃；载气系统为氮气。分流比15∶1；进样体积1 μL；程序升温：初始温度100 ℃保持3 min 后以4 ℃/min 升高至160 ℃持续3 min 后以3 ℃/min 升至250 ℃保持3 min，总程序时间48 min。

1.3.6 柠檬苦素、诺米林、奥巴叩酮含量测定

混合标准溶液的配制：精确称取9.2 mg 柠檬苦素、7.3 mg 诺米林、8.0 mg 奥巴叩酮置于10.00 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，分别得到质量浓度为920、730、800 mg/L 混合标准溶液，置于-20 ℃避光保存。

标准曲线的绘制：将混合标准溶液用乙腈稀释，分别配制9.2、46、92、276、920 mg/L 柠檬苦素标准溶液和7.3、36.5、73、219、730 mg/L 诺米林标准溶液以及8.0、40、80、240、800 mg/L 奥巴叩酮标准溶液，上样前用0.22 μm 滤膜过滤。根据峰面积和质量浓度绘制标准曲线和回归方程。

油脂前处理方法：参考郭烨[15]的方法并适当修改，取瓯柑籽油、椪柑籽油、香橙籽油、胡柚籽油各1 mL，用乙腈定容至10 mL，充分混合均匀静置30 min 避光，放置于-20 ℃储存，上样前用0.22 μm 滤膜过滤。

高效液相色谱条件：Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；检测器为紫外检测器；柱温30 ℃；流动相为乙腈-水（50∶50，体积比）溶液；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm。

1.3.7 橙皮苷、柚皮苷含量测定

混合标准溶液的配制：精确称取4.2 mg 橙皮苷和7.0 mg 柚皮苷置于10.00 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，分别得到质量浓度为420 mg/L 和700 mg/L混合标准溶液。

标准曲线的绘制：将混合标准溶液用甲醇稀释，分别配制4.2、21、42、126、210 mg/L 橙皮苷标准溶液和7.0、35、70、210、350 mg/L 柚皮苷标准溶液，上样前用0.22 μm 滤膜过滤。根据峰面积和质量浓度绘制标准曲线和回归方程。

油脂前处理方法：参考夏钰[16]的方法取瓯柑籽油、椪柑籽油、香橙籽油、胡柚籽油各1 mL 于10 mL 离心管中，各加入2.0 mL 正己烷混合振荡2 min 后加入2.0 mL 80% 甲醇溶液混匀，涡旋3 min，在4 000 r/min的条件下离心15 min，重复以上操作提取3 次，收集离心管中的甲醇提取液，用甲醇定容至10 mL，避光放置于-20 ℃储存，上样前过0.22 μm 滤膜过滤。

高效液相色谱条件：Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；检测器为紫外检测器；柱温30 ℃；流动相为乙腈-0.2% 甲酸水（20:80，体积比）溶液；进样量20 μL；流速0.8 mL/min；检测波长283 nm。

1.4 数据处理

所有试验均重复测定3 次，数据结果采用平均值±标准差表示，使用SPSS 26.0 软件进行数据分析比较，以P＜0.05 作为显著性试验指标。

2 结果与分析

2.1 柑橘籽水分、灰分含量测定结果

柑橘籽的基本成分分析见表1。

表1 柑橘籽的基本成分分析Table 1 Basic components in citrus seeds

由表1 可知，瓯柑籽、椪柑籽、香橙籽、胡柚籽水分含量分别为4.067%、6.260%、5.838%、4.264%，其中椪柑籽与香橙籽的水分含量高于瓯柑籽和胡柚籽。水分含量低说明柑橘籽中干物质含量较多，营养成分含量丰富。灰分含量在3.268%～4.258%之间，证实柑橘籽内含有无机物，其中椪柑籽的无机物含量较其他3 种柑橘籽更为丰富。

2.2 柑橘籽含油率测定结果

柑橘籽含油率见图1。

图1 柑橘籽含油率Fig.1 Oil content in citrus seeds

由图1 可知，瓯柑籽、椪柑籽、香橙籽、胡柚籽通过索氏提取所得到含油率分别为51.35%、47.11%、33.11%、47.09%，与胡隆基等[17]的研究结果一致。其中香橙籽含油率明显低于其他3 种柑橘籽，瓯柑籽含油率最高。4 种柑橘籽中香橙籽体积最大，含油率却最低，可能是因为香橙籽籽粒不饱满，空瘪粒较多，从而导致含油率低，而瓯柑籽、椪柑籽，胡柚籽颗粒饱满丰富，含油率较高。并且这4 种柑橘籽含油率高于玉米（4.3%～4.8%）[18]、大豆（10%～25%）[19]等。不同品种柑橘籽含油率存在差异性也与其生长环境、气候条件、地理来源、基因型以及提取工艺等因素有关[20]。柑橘籽含油率作为重要评价指标为健康植物油的开发提供了依据。

2.3 柑橘籽油脂肪酸组成及相对含量

脂肪酸组成是影响柑橘籽油营养价值的关键指标，其脂肪酸组成及相对含量见表2。

表2 柑橘籽油脂肪酸组成及相对含量Table 2 Fatty acids and relative content in citrus seed oils

由表2 可知，4 种柑橘籽油脂肪酸主要由油酸、亚油酸、棕榈酸以及少量的亚麻酸和硬脂酸构成，其主要不饱和脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸。瓯柑籽油、椪柑籽油、胡柚籽油中成分最高的是亚油酸，含量分别为45.930 0%、38.070 0%、35.130 0%，香橙籽油中亚油酸含量最低，只有17.930 0%，但是油酸含量却高达49.000 0%，显著高于其他3 种柑橘籽油。此外瓯柑籽油中亚麻酸（5.103 0%）含量也高于椪柑籽油（4.027 0%）、香橙籽油（1.327 0%）和胡柚籽油（3.390 0%）。4 种柑橘籽油中不饱和脂肪酸整体含量较高，瓯柑籽油不饱和脂肪酸占总脂肪酸的71.080 0%，高于其他3 种柑橘籽油（67.030 0%～69.020 0%），说明脂肪酸在不同柑橘籽油间相对含量差异性明显。根据不饱和脂肪酸双键数量和位置的不同可将其分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸按照双键位置不同分为ω-3 和ω-6 系列[21]。其中亚麻酸和亚油酸作为典型的ω-3、ω-6 型脂肪酸在预防心血管疾病、降血脂、抗血栓、抗心律失常、作用免疫和神经系统、调控基因表达、维持细胞膜稳定等方面具有重要作用[22]。4 种柑橘籽油中亚油酸含量高于橄榄油（7.03%）、山茶油（7.65%）、冷榨紫苏油（15.23%）等高品质食用油，亚麻酸含量高于花生油（0.33%）、橄榄油（0.69%）、山茶油（0.35%）、玉米油（0.83%），低于紫苏油（65.89%）[23]。多不饱和脂肪酸中亚油酸和亚麻酸是人体的必需脂肪酸，但必须按照科学比例摄入，因此不能仅通过不饱和脂肪酸总含量判断油脂的营养价值。世界卫生组织推荐ω-6 型脂肪酸和ω-3 型脂肪酸比值小于4 是较为合适的营养比例[24]。瓯柑籽油、椪柑籽油、香橙籽油、胡柚籽油ω-6型和ω-3 型脂肪酸的比值为9、9.5、13.5、10.4，亚麻酸整体含量相对不足，但葵花油、玉米油ω-6 型和ω-3 型脂肪酸比例超过70∶1，属于极度缺乏亚麻酸含量的食用油，经对比分析柑橘籽油在多不饱和脂肪酸的配比上具有一定的优势，亚麻酸含量相对不足，后期可与亚麻籽油、紫苏油等富含高含量的亚麻酸配合使用达到营养均衡。

瓯柑籽油中饱和脂肪酸（28.980 0%）含量显著低于椪柑籽油（31.020 0%）、胡柚籽油（33.090 0%）、香橙籽油（30.940 0%），与食用植物油相比，柑橘籽油中饱和脂肪酸含量高于花生油（21.65%）、大豆油（15.63%）、橄榄油（15.63%）、玉米油（14.33%）、山茶油（10.39%）、葵花油（9.97%）等高品质食用油[23]。饱和脂肪酸以棕榈酸为主，摄入过多将导致体内血清低密度脂蛋白以及胆固醇水平的增加，会对人体健康产生不利影响，而柑橘籽油饱和脂肪酸含量偏高，其中含量最低的瓯柑籽油饱和脂肪酸含量比花生油高（7.33%）。从饱和脂肪酸的角度分析柑橘籽油相比于其他高品质植物油不占优势，但柑橘籽作为加工副产物，甚至是农业废弃物，其不饱和脂肪酸含量、多不饱和脂肪酸占比以及原料来源上具有一定优势，在开发功能食用型油脂以及预防相关疾病等领域拥有巨大潜力。

2.4 柠檬苦素类化合物含量测定结果

采用高效液相色谱对4 种柑橘籽油中柠檬苦素化合物含量进行测定，柠檬苦素、诺米林、奥巴叩酮标准品高效液相色谱图见图2。柠檬苦素线性回归方程y=0.12x，R2=0.999；诺米林线性回归方程y=0.114 1x-0.004 5，R2=0.999；奥巴叩酮线性回归方程y=0.379 8x-0.113 9，R2=0.999。

图2 柠檬苦素、诺米林、奥巴叩酮标准品高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatogram of limonin，nomilin and obacunone standards

柠檬苦素类化合物作为柑橘籽中的特征化合物，常用于综合评估。4 种柑橘籽油中柠檬苦素类化合物的含量见表3。

由表3 可知，4 种柑橘籽油均富含柠檬苦素类化合物，其中总含量最高的为香橙籽油（1 949.05 μg/g），显著高于瓯柑籽油（591.98 μg/g）、椪柑籽油（787.44 μg/g）、胡柚籽油（1 531.69 μg/g）。孙志高等[25]采用超声波辅助溶剂萃取法，利用高效液相色谱对长叶橙籽油、红橘籽油、梁平柚籽油中柠檬苦素含量进行测定，测得含量分别为30、50、90 μg/g，诺米林含量分别为200、130、200 μg/g，并且不同提取方法对于同种柑橘籽油中柠檬苦素化合物的含量造成极大影响。通过与表3 数据对比发现，瓯柑籽油、香橙籽油、胡柚籽油中柠檬苦素和诺米林的含量均高于长叶橙籽油、红橘籽油、梁平柚籽油。椪柑籽油中诺米林含量高于以上3 种柑橘籽油，但柠檬苦素含量低于长叶橙籽油、红橘籽油、梁平柚籽油。造成柑橘籽油中的柠檬苦素化合物含量存在差异还可能是由于品种类型、果实的成熟程度等因素[26]。柠檬苦素类化合物作为氧化三萜类物质，是引发柑橘籽苦味的重要原因，经研究发现其具有广泛的生物学特性，在抗氧化、降血脂、抗病毒、抗癌、抗炎、抑菌等方面存在显著作用[27-28]。温靖等[29]发现柑橘果实和种子中含有柠檬苦素类物质对实验动物模型具有显著的抗炎镇痛作用，具有研发缓痛食用油的潜力。林敏等[30]研究发现常山胡柚果皮中富含大量的柠檬苦素和黄酮类物质，通过考察脂肪酶抑制率，证明了柠檬苦素类化合物在降脂作用中产生重要的影响，且含量越高，降脂能力越强。因此柑橘籽油富含大量脂肪酸的同时，高含量的柠檬苦素、诺米林以及奥巴叩酮使柑橘籽油具有开发抑菌、抗炎等功能型油脂的潜力。

2.5 黄酮类化合物含量

采用高效液相色谱对4 种柑橘籽油中橙皮苷和柚皮苷含量进行测定。橙皮苷、柚皮苷标准品以及样品液相色谱图见图3。橙皮苷线性回归方程y=29 277x-31 617，R2=0.999 2；柚皮苷线性回归方程y=30 136x-61 476，R2=0.999 1。

图3 橙皮苷和柚皮苷标准品及样品高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatogram of hesperidin and naringin standards and samples

柑橘籽油中橙皮苷和柚皮苷含量测定结果如表4所示。

表4 柑橘籽油黄酮类化合物含量Table 4 Flavonoids in citrus seed oils

由表4 可知，4 种柑橘籽油中都含有橙皮苷和柚皮苷，含量之间存在一定的差异。其中橙皮苷含量最高的是香橙籽油（17.57 μg/g），含量最低的是瓯柑籽油（15.61 μg/g）。胡柚籽油中柚皮苷含量为（30.10 μg/g），高于椪柑籽油（27.89 μg/g）、瓯柑籽油（27.84 μg/g）、香橙籽油（28.34 μg/g）。柑橘属类植物在不同组织部位如花、叶、果实、种子中都含有丰富的类黄酮类化合物[31]。类黄酮作为重要的生物活性物质在抗氧化、抗癌、预防心血管疾病以及动脉粥样硬化等领域占据着重要作用[32]。Barreca 等[33]研究发现桃金娘叶橙不同组织中柚皮苷等类黄酮含量明显低于其他各组织部位，籽中柚皮苷的含量为24.2 μg/g，经对比发现4 种柑橘籽油柚皮苷的含量均高于桃金娘叶橙籽中柚皮苷的含量。中国作为柑橘生产大国，虽然柑橘种子中的橙皮苷和柚皮苷含量相比于其它部位并不突出，但其作为加工副产物在来源上具有一定优势，并且橙皮苷和柚皮苷作为现代药物心血管疾病的主要成分，对相关疾病的治疗以及预防有着积极的作用，因此科学地开发与利用，可以有效提高经济效益。

3 结论

本研究发现4 种柑橘籽含有丰富的脂肪酸，是良好的油脂来源，瓯柑籽、椪柑籽、香橙籽、胡柚籽通过索氏提取，含油率分别为51.35%、47.11%、33.11%、47.09%，瓯柑籽含油率最为丰富，香橙籽含油率低。

在脂肪酸组成上，4 种柑橘籽中脂肪酸主要由亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸组成。不同品种柑橘籽油脂肪酸组成及含量存在明显差异，其中瓯柑籽油、椪柑籽油、胡柚籽油中脂肪酸含量最高的是亚油酸，含量分别为45.93%、38.07%、35.13%，香橙籽油中的亚油酸含量最低，只有17.93%，但油酸含量却高达49.00%，显著高于其他3 种柑橘籽油，但不饱和脂肪酸仍然是主要成分，均达到了较高水平，含量从高至低依次为瓯柑籽油、香橙籽油、椪柑籽油、胡柚籽油。其中瓯柑籽油不饱和脂肪酸总量高达71.08%，高于其他3 种柑橘籽油（67.03%～69.02%），并且瓯柑籽油在亚油酸和亚麻酸配比上相较于其他3 种柑橘籽油更具有优势。

柑橘籽油中还含有丰富的柠檬苦素类化合物和类黄酮化合物，其含量因品种而异。香橙籽油中主要的柠檬苦素类化合物总含量（1949.05 μg/g）显著高于瓯柑籽油（591.98 μg/g）、椪柑籽油（787.44 μg/g）、胡柚籽油（1531.69 μg/g），而4 种柑橘籽油中橙皮苷、柚皮苷含量整体差距不大。因此4 种柑橘籽油具备开发绿色健康食用油和功能保健品的潜力，也可成为柠檬苦素类化合物和亚油酸的良好来源，在今后的研究分析中可对柑橘籽油组分与性状间的关系、生物体内活性实验、新型功能产品开发等方面进行探究，从而提高生物资源的开发与利用。