乳双歧杆菌Probio-M8发酵乳缓解便秘的作用

李培培，李树森，孙二娜，王月娇，刘巨龙*

（1.内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京 101107）

便秘是常见的消化道疾病，主要表现为粪便干结、排便困难和排便次数少等，常见于儿童和老年人。儿童的肠胃功能尚未发育完全，容易受到环境、饮食和肠道菌群失调等因素的影响[1]；而老年人是由于身体机能退化、肠道功能降低、饮食结构不均衡、缺乏运动和饮水量减少等原因[2]，成为便秘的高发人群。便秘会降低患者的生活质量，严重时会威胁患者的健康，引起炎症反应，破坏肠黏膜[3]，导致腹痛、腹胀、肛裂、痔疮和肠穿孔，甚至会诱发高血压、心血管疾病和结肠癌等[2，4]，同时由于排便压力，部分人会患上不同程度的精神疾病[5]。目前便秘的治疗方式主要有药物、非药物和手术治疗3 种，药物治疗通常伴随着副作用，长期使用会使患者的耐药性增加，治疗效果不佳[6]。肠道微生态失调是形成便秘的一种原因[7]，肠道菌群紊乱会导致胆汁酸代谢失调，引起近端结肠蠕动障碍，从而导致便秘的发生。益生菌可调节宿主肠道微生物的组成，改善肠道环境，被广泛应用于缓解便秘的研究中，因其具有无副作用、可缓解肠道炎症和促进肠道蠕动等优点，受到了广泛的关注。双歧杆菌是目前应用较多的益生菌，对便秘有很好的缓解效果。张琪等[8]通过动物实验和人群实验探究乳双歧杆菌IU-100 对便秘的缓解作用，发现小鼠和受试者饮用IU-100 菌株发酵乳后，排便次数、时间和状况等均得到改善。李亦汉等[3]使用两歧双歧杆菌CCFM1167 干预便秘小鼠，发现CCFM1167 可以通过减轻肠道炎症达到缓解小鼠便秘的目的。综上，诸多研究已经证实双歧杆菌部分菌株对便秘存在缓解作用。

乳双歧杆菌Probio-M8（BifidobacteriumlactisProbio-M8，Probio-M8）是从中国健康妇女母乳中筛选分离出的一株具有益生特性的菌株，研究发现Probio-M8菌株具有较高的胆盐和胃肠液耐受性[9]，可以改善宿主体内炎症因子水平，调节肠道菌群，并可缓解腹泻的症状[10]。本研究通过动态体外仿生消化系统评价发酵乳中Probio-M8 菌株的胃肠液耐受性，并招募35 名便秘患者，开展28 d 的Probio-M8发酵乳干预实验，探究Probio-M8发酵乳对便秘的缓解作用，以期为双歧杆菌在便秘中的应用研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌株与材料

乳双歧杆菌Probio-M8（BifidobacteriumlactisProbio-M8，Probio-M8）：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室；商业基础发酵剂PYS-010（由唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成）：北京科拓恒通生物技术股份有限公司。

生牛乳：蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司；白砂糖：中粮糖业有限公司；MRS 固体培养基：英国Oxoid 公司；L-半胱氨酸盐酸盐（分析纯）：青岛海博生物技术有限公司；体外仿生胃肠模拟液粉剂（胃液模拟液粉剂、肠液模拟液粉剂）、CaCl2（分析纯）、MgCl2（分析纯）、胃蛋白酶（2 000 U/mL）、胰蛋白酶（100 U/mL）、胆盐（10 mmol/L）：晓东宜健（苏州）仪器设备有限公司；NaCl、NaHCO3、HCl（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pHS-3C 型pH 计：上海雷磁技术有限公司；HWS28 型恒温水浴锅：上海智城分析仪器有限公司；SRH 60-70 型均质机：上海申鹿均质机有限公司；GNP-9080 型恒温培养箱：天津市中环实验电炉有限公司；HA-300MII1 型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本HIRAYAMA 公司；CP2202C 型分析天平：奥豪斯仪器有限公司；DHSI-Ⅳ型动态人胃肠体外仿生消化设备：晓东宜健（苏州）仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 益生菌发酵乳制备

将生牛乳预热至45 ℃，添加白砂糖混合均匀，化料15 min 后升温至60 ℃进行均质，均质压力为20 MPa，随后在95 ℃条件下杀菌5 min，杀菌完毕冷却至37 ℃后接种商业基础发酵剂（接种量为0.03‰）和Probio-M8 菌株（接种量为6×106CFU/mL），置于37 ℃恒温培养箱中进行发酵，发酵至pH4.60 时停止，破乳搅拌随后灌装，置于4 ℃冷藏后熟。

1.2.2 益生菌发酵乳活菌数测定

采用GB 4789.34—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验》对Probio-M8发酵乳进行活菌数测定。

1.2.3 动态体外仿生消化系统菌株存活率测定

1.2.3.1 模拟液的配制

模拟液包括胃液模拟液（simulated gastric fluid，SGF）和肠液模拟液（simulated intestinal fluid，SIF）。SGF 的制备方法[11]：以配制100 mL 的SGF 为例，取80 mL 胃电解质储备液（SGF 粉剂、0.825 mL MgCl2、3.25 mL 6 mol/L HCl）与50 μL CaCl2和18.5 mL 去离子水混合，用6 mol/L HCl 调节pH1.5，加入胃蛋白酶，调至胃蛋白酶的终浓度为800 U/mL，充分溶解后用0.22 μm 的无菌过滤膜进行过滤除菌，最后置于室温阴凉处待用。SIF 的制备方法[11]：以配制100 mL 的SIF为例，取80 mL 肠电解质储备液（SIF 粉剂、2.75 mL MgCl2、1.75 mL 6 mol/L HCl）与200 μL CaCl2和19 mL去离子水混合，用6 mol/L HCl 调节pH6.5，加入胰蛋白酶和胆盐，调至胰蛋白酶和胆盐的终浓度分别为200 U/mL 和20 mmol/L，充分溶解后用0.22 μm 的无菌过滤膜进行过滤除菌，最后放置室温阴凉处待用。

1.2.3.2 动态体外仿生消化

动态体外仿生胃肠道消化设备主要由模拟食管、3D 仿生人胃、十二指肠、四节小肠和大肠过滤装置组成，其已经被证实可以有效模拟发酵乳在胃肠道的消化过程[12]。试验期间先打开设备电源，启动并进行预热，胃肠液的温度控制在37 ℃左右，并根据成人胃肠道消化环境设定仪器各项参数（如胃肠消化液分泌速率、食道开放速率、胃和小肠蠕动频率等）。设定好设备后，将发酵乳从进样口倒入，分别在消化60 min 和120 min时从胃和肠道末端吸取4 mL 食糜进行活菌数测定。

1.2.3.3 发酵乳中益生菌活菌数测定与存活率计算

参考伍鹏等[11]的方法，分别测定Probio-M8发酵乳贮藏1 d 和28 d 时经过模拟胃肠道消化后的活菌数。当消化60 min 和120 min 时，分别在胃和肠道末端收集消化食糜，振荡均匀后进行活菌计数。将经过消化0、60 min 和120 min 样品的活菌数以N0、N60、N120（CFU/mL）表示，计算经消化60 min 和120 min 时菌株的存活率。消化60 min 时菌株在胃和肠道中的存活率按式（1）和（2）进行计算；消化120 min 时菌株在胃和肠道中的存活率按式（3）和（4）进行计算。

式中：S60min、S120min分别为发酵乳在胃中消化60、120 min 后Probio-M8 菌株的存活率，%；I60min、I120min分别为发酵乳在肠道中消化60、120 min 后Probio-M8 菌株的存活率，%；C0为发酵乳未经消化的Probio-M8 菌株活菌数，CFU/mL；CG60、CG120分别为胃内消化60、120 min 时Probio-M8发酵乳的活菌数，CFU/mL；V0为样品体积，120 mL；V1、V11分别为消化60、120 min 胃中进入的模拟胃液总体积（含HCl），mL；CI60、CI120分别为肠道消化60、120 min 时Probio-M8发酵乳的活菌数，CFU/mL；V2、V22分别为消化60、120 min 肠道中进入的模拟肠液总体积（含NaHCO3），mL；4 为60 min 时从胃内取出的样品体积，mL。

1.2.4 人群实验设计

1）筛选标准。年龄20～50 岁；参考美国胃肠道委员会制定的罗马Ⅳ临床便秘诊断标准[13]，受试者应至少符合以下两项症状：每4 次排便至少有1 次排便费力；每4 次排便至少有1 次排便类型为Bristol 粪便性状分型中的1 型；每4 次排便至少有1 次有排便不尽、肛门阻塞感；每周排便次数少于3 次。

2）排除标准。15 d 前服用过抗生素、精神类药物；确诊患有肠道器质性疾病；妊娠或哺乳期妇女；对样品成分过敏；拒绝签署知情同意书。

3）干预措施。对符合筛选标准的35 名便秘患者进行7 d 排空期后，进行28 d 饮用期的临床实验，受试者每日饮用一瓶200 g 的Probio-M8发酵乳，活菌数为1×1010CFU/瓶。饮用期间，每周从排便频次、排便类型和排便用力程度3 个方面对受试者便秘情况进行评价，每周进行询问并记录评分。排便类型评价参照Bristol 粪便性状分型进行评分[14]，标准如表1所示。排便用力程度评分范围为0～3[15-16]，分数增加表示排便用力程度增加。

表1 Bristol 粪便性状分型评分标准Table 1 Bristol stool scoring scale

4）改善有效率计算。根据受试者对排便类型和排便用力程度的评分计算改善有效率[13，15]，并按照不同年龄段进行分析。改善有效率计算公式如下。

式中：C为改善有效率，%；W1为疗效评估结果是痊愈、显效和有效的人数；W0为总人数。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。显著性水平为p＜0.05。由Origin Lab 2021 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 发酵乳活菌数

足量的活菌数对于益生菌发挥益生功效极其重要，益生菌在进入体内后，会受到胃酸、胆盐和各种消化酶等不利因素的影响，只有较高的活菌数才能抵御胃部的恶劣环境，保证一定数量的活菌到达肠道，并对宿主健康产生积极影响[17]。由此可知，Probio-M8发酵乳只有达到一定的活菌数才能更好地发挥菌株的益生功效。发酵结束后，对发酵乳中Probio-M8 进行活菌计数，结果为1.0×108CFU/g。根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》规定，发酵乳中的乳酸菌活菌数应达到106CFU/g 以上，Probio-M8发酵乳符合国家标准。此外，试验期间对Probio-M8 菌株进行活菌数测定，发现整个试验期间样品的活菌数均可达107CFU/g 以上，符合国家标准。

2.2 发酵乳中Probio-M8 菌株存活率变化情况

动态体外仿生胃肠道消化设备可以模拟人体动态消化过程，较为真实地反映Probio-M8发酵乳经过人体消化后Probio-M8 菌株的存活率。贮藏1 d 和28 d的Probio-M8发酵乳经过动态体外仿生消化后，Probio-M8 菌株在胃内存活率变化情况如图1所示。

图1 贮藏1 d 和28 d 的发酵乳胃内Probio-M8 存活率Fig.1 Gastric survival rates of Probio-M8 in the fermented milk stored for 1 day and 28 days

由图1 可知，在体外仿生胃内消化60 min 时，贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分别为82.3% 和74.3%；消化120 min 时，贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分别为46.9% 和42.1%。综上，整个试验期间的Probio-M8发酵乳在体外仿生胃内消化60 min后，Probio-M8 菌株的存活率可高达70% 以上；消化120 min 后，存活率仍可保持在40%以上。

贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳在体外仿生肠道内消化后，Probio-M8 菌株存活率变化情况如图2所示。

图2 贮藏1 d 和28 d 的发酵乳肠道内Probio-M8 存活率Fig.2 Intestinal survival rates of Probio-M8 in the fermented milk stored for 1 day and 28 days

由图2 可知，在体外仿生肠道内消化60 min 时，贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分别为47.6% 和43.7%，消化结束后（120 min），贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分别为22.1% 和18.8%。综上，整个试验期间的发酵乳在体外仿生肠道内消化60 min 后，Probio-M8 菌株存活率可达40%以上；消化结束（120 min）时，仍保留20%左右的存活率。

综上可知，贮藏1 d 和28 d 的Probio-M8发酵乳经过体外仿生胃肠道消化120 min 后，Probio-M8 菌株存活率可保持在18%以上，试验初始和结束时Probio-M8 菌株存活率无明显差异。表明Probio-M8 菌株具有较好的胃肠液耐受能力，在整个试验期间都可维持一定的存活率，能够在宿主胃肠道中大量存活，可发挥相应的健康功效。

2.3 人均排便频次变化情况

排便次数少是便秘的一种症状表现，经研究可知，正常人的排便频次应为每周3 次以上[18]。本研究受试者饮用发酵乳后人均排便频次改变情况如图3所示。

图3 人均排便频次Fig.3 Per capita defecation frequency

由图3 可知，排空期受试者人均排便2.27 次，饮用Probio-M8发酵乳1 周后，受试者的人均排便频次为3.87 次，到达了正常的排便频次，与排空期存在显著差异（p＜0.05）。第2 周受试者的人均排便频次达到5.20 次，并且直到实验结束每周人均排便频次稳定在5 次以上。第4 周时，受试者人均排便频次比排空期增加148%。结果表明，饮用Probio-M8发酵乳可以增加排便次数，缩短肠道运输时间，使得肠道蠕动频率恢复正常，从而改善便秘。

2.4 排便类型变化情况

以Bristol 粪便性状分型为标准对粪便进行评价，受试者饮用Probio-M8发酵乳后，人均排便类型评分变化情况如图4所示，排便类型改善有效率如表2所示。

图4 人均排便类型评分Fig.4 Per capita stool scale score

表2 排便类型改善有效率Table 2 Stool scale improvement rate%

由图4 可知，受试者饮用Probio-M8发酵乳后，人均排便类型评分明显降低，第4 周评分较排空期显著降低了63.67%（p＜0.05）。由表2 可知，不同年龄段的受试者在饮用发酵乳后，排便类型均得到了不同程度的改善。40～50 岁的受试者在饮用发酵乳3 周后改善有效率达到了100.00%，粪便表现为光滑柔软、容易排出。20～30 岁的受试者在实验结束后排便类型改善有效率为81.02%，30～40 岁受试者在实验结束后排便类型改善有效率为77.46%，排便类型均得到了明显改善，趋于正常状态。粪便的性状是便秘的直观表现形式，坚硬的粪便会增加排便难度和延长排便时间。结果表明，Probio-M8发酵乳可以改善便秘患者的排便类型，减少水分吸收，使得粪便更易排出，改善便秘患者的生活质量。

2.5 排便用力程度变化情况

受试者饮用Probio-M8发酵乳后，排便用力程度评分变化情况如图5所示，排便用力程度改善有效率如表3所示。

图5 人均排便用力程度Fig.5 Per capita bowel movement effort

表3 排便用力程度改善有效率Table 3 Improvement rate of bowel movement effort%

由图5 可知，在排空期内受试者均表现为排便困难，需要十分用力排出粪便，饮用Probio-M8发酵乳后，人均排便用力程度评分显著降低（p＜0.05），饮用4周后人均排便用力程度评分降低了48.34%。由表3可知，不同年龄段的受试者饮用Probio-M8发酵乳后，排便用力程度改善有效率表现出了差别，40～50 岁的受试者第3 周的改善有效率达到了100.00%，效果明显，表现为排便顺畅。20～30 岁的受试者在实验结束时排便用力程度改善有效率达到了87.50%。

3 讨论

近年来随着生活习惯的改变和社会压力的增加，便秘患病率逐年增加，影响患者的健康及生活质量。越来越多的研究证明益生菌可以改善便秘，并已被投入便秘的辅助治疗中。本研究发现Probio-M8发酵乳经过120 min 体外仿生消化后，Probio-M8 菌株存活率可保持20%左右，具有良好的耐胃肠液能力。人群实验中，受试者在饮用Probio-M8发酵乳后，排便频次增加、排便类型趋于正常、排便用力程度显著降低，与相关研究人员对益生菌缓解便秘作用的研究结果一致[19]，具有缓解便秘的功效，未来可被广泛应用到便秘的辅助治疗中，用于改善便秘症状和提升患者的生活质量。本研究中Probio-M8发酵乳对不同年龄段受试者的排便类型和排便用力程度改善有效率呈现差异，30～40 岁的受试者改善有效率最低，可能与其在工作和生活方面的压力较大有关，已有研究证实精神和心理因素是引起便秘的重要原因之一[20]。

关于益生菌干预便秘的研究中发现，益生菌可通过多种途径改善便秘。白晓晔[21]发现便秘志愿者在食用益生菌发酵乳后，体内炎症因子水平明显下降，血液中炎症因子C-反应因子和脂多糖显著降低，抗炎因子脂多糖结合蛋白和白细胞介素-10 显著增加，推测益生菌发酵乳可减轻炎症，改善肠动力，促进肠道蠕动。刘文君[18]对比了实验期间益生菌组和安慰剂组的肠道菌群组成，结果发现相比于安慰剂组，摄入植物乳植杆菌P9 后，便秘患者肠道内植物乳植杆菌和双歧杆菌等有益菌株含量显著升高，粪拟杆菌和芬氏别样杆菌等菌株丰度下降，表明益生菌可以改变肠道菌群组成，以此对便秘产生影响。李亦汉[7]利用动物实验，探究双歧杆菌缓解便秘的机制，发现双歧杆菌可以下调与肠道水分重吸收相关蛋白质的基因水平，以此改善排便类型。另外，双歧杆菌还可以通过上调部分次级胆汁酸和下调部分初级胆汁酸的含量，影响胆汁酸代谢。胆汁酸受体的激活可以恢复免疫平衡、提高粪便的含水量和促进肠道蠕动，以此实现便秘的改善。综上，推测Probio-M8发酵乳可能通过降低患者体内的炎症水平、调节肠道菌群的组成和影响胆汁酸代谢等途径，改善受试者的便秘症状。由于便秘成因复杂，实验中不同年龄段的便秘患者对于Probio-M8发酵乳应答情况有所不同，具体成因还需要增加受试人群规模，完善整个实验，并通过多组学联用共同进行解析并深入研究。

4 结论

本研究通过动态体外仿生消化系统测试和人群实验发现，乳双歧杆菌Probio-M8发酵乳中益生菌Probio-M8 具有良好的耐胃肠液能力，能以活菌状态到达肠道发挥益生功效，并且可以通过改善排便类型、增加排便频次和降低排便用力程度缓解便秘症状。