植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉营养组分的影响

耿浩，张智，温纪平*，石松业，展小彬

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450000；2.国家小麦加工技术研发专业中心，河南郑州 450000；3.黑龙江省北大荒米业集团有限公司，黑龙江哈尔滨 150000）

近年来，越来越多的研究表明，全谷物食品在预防慢性疾病中起重要作用[1]，许多流行病学研究表明，全谷物摄入量的增加能够有效降低2 型糖尿病、心脑血管疾病和癌症的发病率[2]。虽然这些作用的潜在机制尚未完全阐明，但是谷物麸皮层中含有针对代谢疾病的化学物质这一概念已经被更多的人认识和接受[3]。

小麦是全世界范围内的主要粮食作物，且具有一定的营养价值，糊粉层是小麦麸皮的主要成分，糊粉层亦称外胚乳，是位于籽粒皮层的内层细胞[4]，糊粉层细胞的细胞质中包含了大量矿物质（占小麦籽粒总矿物质含量的40%～60%）、蛋白质（约占小麦总蛋白质含量的15%）、B 族维生素、植物甾醇和植酸盐[5-6]。小麦籽粒的硫胺素、核黄素以及大部分的类胡萝卜素也主要存在于糊粉层粉中[7]，同时，小麦糊粉层也是木质素的主要来源，尤其是丁香树脂醇。由于其营养丰富和潜在的健康作用，以及新型制粉技术的发展，小麦糊粉层在食品加工领域逐渐被用作代替麸皮的新型原料，因此在研究和开发全麦面包领域进行了较多应用，已有研究表明，以小麦糊粉层添加量为20% 制作面包，营养成分与全麦面包相当，但风味和外观更接近精致小麦粉制作的面包，并且添加糊粉层粉的产品品质高于全麦面包[8]。然而，在小麦粉相关的产品中添加糊粉层，会表现出比市售白面包更小的比容和更粗糙的质地，这可能会影响消费者的感官接受度[9]。

酸面团发酵技术能够将谷物粉转化为口感好、易消化的产品。其产生作用的关键在于乳酸菌或酵母菌的应用，其中，乳酸菌在酸面团生产中起核心作用[10]。乳酸菌发酵是一种天然且可持续的方法，通过发酵处理能够确保适当的卫生、感官和良好的保质期，同时提高食品的功能或营养价值[11]。在酸面团发酵过程中，乳酸菌主要负责酸化和蛋白质水解，这两种现象在不同方面广泛影响酸面团的感官和营养特性，通过生产有机酸使原料快速酸化，并通过合成乙醇、芳香化合物、细菌素、胞外多糖和酶，提升产品的综合竞争力[12]。

植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌株，以葡萄糖、果糖及乳糖等为原料进行新陈代谢，同时产酸，由于其较好的益生菌特性（良好的附着力、抗氧化性和抗菌特性），植物乳杆菌在食品工业中具有许多功能特性，例如提升营养价值、风味特性、抗氧化活性、抗菌活性，延长食品的保质期[13-14]，因此，植物乳杆菌常被用作食品微生物发酵剂，例如腌制酸菜、酸面团等[15]。使用植物乳杆菌对小麦糊粉层粉进行酸面团发酵，将明显提高其抗氧化特性、风味物质含量以及营养功能特性，具有十分重要的意义。

本文以小麦糊粉层粉为原料，接种植物乳杆菌进行发酵，利用响应面优化试验探究酸面团发酵对小麦糊粉层粉营养品质的影响，以期为糊粉层粉产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦糊粉层粉：山东知食坊食品科技有限公司；植物乳杆菌JCM1149 菌种：保藏于河南工业大学粮油食品学院；MRS 肉汤、MRS 培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；福林酚：上海麦克林生化科技股份有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津天力化学试剂有限公司；碳酸钠（分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

手提式压力蒸汽灭菌器（DSX-280B 型）：上海申安医疗器械厂；生化培养箱（SPX-250B-Z 型）：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；恒温水浴振荡器（THZ-82A 型）：江苏杰瑞尔电器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A 型）：上海精宏实验设备有限公司；单人单面垂直净化工作台（SW-CJ-1D 型）：苏州智净净化设备有限公司；超声波清洗器（KQ-500DE 型）：昆山市超声仪器有限公司；紫外分光光度计（UV2150）：尤尼柯（上海）仪器有限公司；冷冻干燥机（Freezone6 plus型）：美国Labconco 有限公司；高速离心机（LXJ-IIB）：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 JCM1149 菌株活化

挑取斜面保藏的JCM1149 菌株接种至10 mL 无菌MRS 液体培养基中，之后将其放置于37 ℃生化培养箱恒温培养24 h，吸取1 mL 接种于100 mL MRS 培养基中，厌氧培养24 h 后，将菌液吸取至10 mL 离心管中，加入5 mL 灭菌生理盐水，摇匀后，2 500 r/min 离心5 min，弃上清液，重复洗涤3 次后，加入5 mL 无菌水，摇匀，得到JCM1149 菌液。

1.3.2 酸面团及冻干样品的制备

称取100.0 g 小麦糊粉层粉，加入菌液和一定量的水，和面5 min，之后放置于恒温培养箱中厌氧发酵，发酵完成后即为JCM1149 糊粉层粉酸面团，将酸面团装在小型自封袋中，于-40 ℃冰箱中预冻备用。

将自封袋中预冻完成的酸面团样品掰成小块，放置于冷冻干燥机中冻干2 d，取出冻干样品研磨成粉，用于后续试验。

1.3.3 小麦糊粉层粉酸面团发酵单因素试验

以发酵温度35 ℃、发酵时间20 h，JCM1149 接种量1.4×107CFU/g 为基础配方，分别对发酵温度（25、30、35、40、45 ℃）、发酵时间（12、16、20、24、28 h）、JCM1149 接种量（1.4×105、1.4×106、1.4×107、1.4×108、1.4×109CFU/g）进行单因素试验，研究各因素对发酵小麦糊粉层粉中多酚含量的影响。

1.3.4 小麦糊粉层粉酸面团发酵响应面试验

参考1.3.3 单因素试验结果，按照Box-Behnken 中心组合试验设计原理，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）、JCM1149 接种量（C）为自变量，以JCM1149 糊粉层粉酸面团的多酚含量（R1）为响应值，进行响应面优化试验，响应面试验设计见表1。

表1 响应面试验设计Table 1 Levels of response surface factors

1.3.5 酸面团总多酚含量的测定

参照徐小娟[16]的方法并稍作修改，准确称取0.4 g酸面团冻干样品于离心管中，加入80% 乙醇30 mL，磁力搅拌30 min，35 ℃超声提取30 min 后2 500 r/min离心10 min，取上清液，再向离心管中加入20 mL 80%乙醇，重复上述操作，2 次上清液合并，乙醇定容于50 mL 容量瓶，摇匀待测。取1 mL 待测液加入0.5 mL福林酚混匀静置5 min，加入3 mL 10%Na2CO3溶液摇匀，30 ℃水浴振荡2 h，于740 nm 处测定吸光度。结果以没食子酸当量表示mg/mL。测得的标准曲线为Y=29.091X+0.000 5，R2=0.999 8。

1.3.6 营养物含量的测定

膳食纤维含量：测定方法参照GB/T 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》；粗蛋白含量：测定方法参照GB/T 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；钙含量：测定方法参照GB 5009.92—2016《食品安全国家标准食品中钙的测定》；钾含量：测定方法参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》；镁含量：测定方法参照GB 5009.241—2017《食品安全国家标准食品中镁的测定》；锰含量：测定方法参照GB 5009.242—2017《食品安全国家标准食品中锰的测定》；钠含量：测定方法参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》；铁含量：测定方法参照GB 5009.90—2016《食品安全国家标准食品中铁的测定》；铜含量：测定方法参照GB 5009.13—2017《食品安全国家标准食品中铜的测定》；锌含量：测定方法参照GB 5009.14—2017《食品安全国家标准食品中锌的测定》；氨基酸组成：测定方法参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》；维生素B1；测定方法参照GB 5009.84—2016《食品安全国家标准食品中维生素B1的测定（含第一号修改单）》第一法；维生素B2：测定方法参照GB 5009.85—2016《食品安全国家标准食品中维生素B2的测定》第一法；维生素B6：测定方法参照GB 5009.154—2016《食品安全国家标准食品中维生素B6的测定》第一法；维生素E：测定方法参照GB 5009.82—2016《食品安全国家标准食品中维生素A、D、E 的测定》第一法；烟酸：测定方法参照GB 5009.89—2016《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》第一法；叶酸：测定方法参照GB 5009.211—2022《食品安全国家标准食品中叶酸的测定》。

1.4 数据统计与分析

采用Excel、Design-Expert 13.0.1.0 软件进行数据分析，Origin 2019 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵温度单因素试验

在JCM1149 接种量为1.4×107CFU/g、发酵时间为20 h 的条件下，不同发酵温度对JCM1149 酸面团中多酚含量的影响见图1。

图1 发酵温度对JCM1149 酸面团多酚含量的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

由图1 可知，微生物在发酵酸面团的过程中，代谢产生的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶可从不溶解基质中释放出结合酚类化合物，并将其水解为游离形式，从而提高发酵产物中的多酚含量[17]。结合发酵温度对酸面团多酚含量的影响，最终选用30、35、40 ℃的温度范围进行后续响应面发酵试验。

2.1.2 发酵时间单因素试验

在发酵温度为35 ℃、JCM1149 接种量为1.4×107CFU/g 时，发酵时间对JCM1149 酸面团中总多酚含量的影响见图2。

图2 发酵时间对JCM1149 酸面团多酚含量的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

如图2所示，随着发酵时间逐渐延长，酸面团内的微生物开始大量繁殖，分泌的酶量增加，促进了多酚类化合物的形成[18]，并在发酵时间为20 h 时达到最大值，之后，由于发酵菌株的生长活力开始下降，部分菌株死亡，细胞内的多种酶被释放出来，导致了酸面团内的多酚物质被氧化、消化或降解[19]。结合发酵时间对酸面团多酚含量的影响，选用16、20、24 h 的发酵时间进行后续响应面试验。

2.1.3 JCM1149 接种量单因素试验

JCM1149 接种量对JCM1149 酸面团多酚含量的影响见图3。

图3 JCM1149 接种量对JCM1149 酸面团多酚含量的影响Fig.3 Effect of JCM1149 inoculum amount on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

由图3 可知，在发酵过程中，微生物能以芳香氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）为前体物质，在生物酶的作用下合成多酚、黄酮等次级产物[20]。当JCM1149 接种量增加，超出了适度范围，此时由于发酵菌数量较多，使得酸面团培养基无法提供足够的生长底物，反而增加了酒精和酸类产物的积累，限制了多酚、黄酮等产物的合成[21]。因此，选用1.4×106、1.4×107、1.4×108CFU/g的JCM1149 接种量进行后续响应面试验。

2.2 响应面优化小麦糊粉层粉酸面团发酵工艺

2.2.1 响应面优化试验结果

以JCM1149 糊粉层粉酸面团多酚含量（R1）为响应值，建立小麦糊粉层粉酸面团的发酵工艺，试验设计及结果如表2所示。

表2 响应面试验结果Table 2 Result of response surface

对试验结果进行多项回归拟合，得到回归方程：多酚含量=-16.369 43+0.684 6A+0.164 2B+0.214 9C+0.003 0AB+0.003 4AC-0.006 1BC-0.010 9A2-0.005 4B2-0.156 4C2。

响应面二次模型的变量回归分析见表3。

表3 响应面二次模型的变量回归分析Table 3 Variable regression analysis of response surface quadratic model

由表3 可知，本试验模型F值为315.93，p值＜0.000 1，说明回归方程模拟性极显著，失拟项p值为0.078 4＞0.05，说明方程拟合性良好，因此模型可靠。R2=0.997 5，R2Adj=0.994 4，说明试验拟合性良好，试验误差较小，可以良好地反映试验各因素与响应值之间的关系。得出主次因素为发酵时间＞发酵温度＞JCM1149 接种量，响应值为多酚含量时，发酵的最佳条件为发酵时间22 h、发酵温度38 ℃、JCM1149 接菌量1.4×107CFU/g，发酵后JCM1149 酸面团多酚含量为（2.31±0.01）mg/g。

2.2.2 响应面试验各因素交互作用

响应面试验中不同因素间交互作用见图4。

不同因素间的交互作用AB、AC、BC对响应值均有显著性影响（p＜0.05），由图4 可知，各因素坐标点均位于响应面及等高线中心区域，进一步表明该模型拟合性良好，各因素对多酚含量有显著提升作用。

2.3 植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉营养物含量的影响

2.3.1 植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉粗蛋白质及膳食纤维含量的影响

小麦糊粉层粉的蛋白质及膳食纤维含量见表4。

表4 小麦糊粉层粉的蛋白质及膳食纤维含量Table 4 Protein and dietary fiber content in the powder of wheat aleurone layer

由表4 可知，经植物乳杆菌发酵，小麦糊粉层粉中蛋白质含量有所降低，有研究表明，基质在发酵过程中粗蛋白含量出现小幅度下降，可能是由于基质中存在的霉菌将蛋白类物质转化为无机氨态氮[22]，并且在发酵过程中，植物乳杆菌的生长繁殖也会消耗一定量的蛋白，因此，乳酸菌发酵导致的粗蛋白含量变化是微生物消耗蛋白和产生菌体蛋白的共同结果。

研究发现，不溶性膳食纤维会明显降低面粉制品的产品性质，如硬度增加、色泽下降、口感粗糙等[23]。在膳食纤维含量分析中，发酵过的小麦糊粉层粉与未发酵相比，不溶性膳食纤维和总膳食纤维含量明显降低，而可溶性膳食纤维含量明显增加，这是因为在发酵过程中，纤维组分的化学性质发生变化，部分不溶性膳食纤维被转化为可溶性膳食纤维，并且乳酸菌发酵可以激活杂粮基质中的天然纤维素酶，其中内切葡聚糖酶可将不溶性膳食纤维长链降解为小分子的可溶性膳食纤维[24-25]，乳酸菌在生长过程中产生的纤维素水解酶如β-葡聚糖酶和木聚糖酶可以降解麸皮类基质中纤维素成分的β-糖苷键，从而增加糊粉层中可溶性膳食纤维的含量。此外，乳酸菌发酵后，基质中乳酸含量增加，pH 值降低，在酸性条件下糖苷键断裂产生新的还原性末端，降低了纤维类大分子的聚合度，同时增加了可溶性膳食纤维的含量[26]。这一变化使得纤维组分功能更优，且面团的加工适应性更好。

2.3.2 植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉矿物质含量的影响

小麦糊粉层粉的矿物质含量见表5。

表5 小麦糊粉层粉的矿物质含量Table 5 Mineral content in the powder of wheat aleurone layer

由表5 可知，在小麦糊粉层中可检测出多种矿物质成分，其中，镁元素含量最高，其次是钙，钠元素相对较低，通过植物乳杆菌发酵，多数矿物质含量明显上升，铁元素与钾元素含量略微降低，这其中包含了发酵与样品冻干过程中水分变化造成的影响，以及部分微量元素随水分流失而产生的差异。但在更多情况下，矿物质含量的变化主要是因为糊粉层粉中植酸含量以及植酸酶活性变化。植酸是谷物中主要的抗营养因子之一，在小麦、黑麦和水稻中主要存在于糊粉层组织，约占总植酸含量的90%[27]，植酸对营养属性带来的负面影响主要来自于它与铁、钙、镁、锌、锰等金属离子都能形成不可溶解的螯合物，其中植酸与锌形成的螯合物最为稳定，正因这种螯合特性，导致金属离子流动性变差，妨碍人体吸收。植酸酶可将植酸去磷酸化，将植酸的化学结构由稳定的六磷酸结构降解为游离的无机磷酸盐和肌醇磷酸酯[28]，从而释放被植酸螯合的金属离子，恢复其溶解性并提高生物利用率。植酸酶存在于谷物、乳酸菌和酵母菌中，且常伴随环境表现出不同活性，而在发酵过程中，碳水化合物在没有外部电子受体的情况下被氧化以释放能量，同时，发酵过程中pH值逐渐降低，植酸酶活性在某一时刻达到最高，从而使原料中植酸含量明显减少，矿物质含量增加，因此，酸面团发酵是溶解小麦面团中矿物质的有效手段。

2.3.3 植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉B 族维生素含量的影响

维生素是维持人体代谢的重要营养素，但因在人体内合成受限，往往通过食物从外界获取。谷物是维生素的优质天然来源，尤其是核黄素、烟酸、叶酸等B 族维生素含量丰富，对维持机体维生素平衡具有一定的积极作用[29]。B 族维生素含量的测定结果见图5。

图5 小麦糊粉层粉的B 族维生素含量Fig.5 Content of B vitamins in the powder of wheat aleurone layer

由图5 可知，在检测出的维生素中，烟酸和维生素E 含量最高，经植物乳杆菌发酵处理，含量较之前相比分别提升了50.90% 和79.29%，此外VB1、VB2、VB6含量均有明显提升，这可能由于发酵过程中有机酸不断积累，造成酸度下降，维生素对发酵时期pH 值具有较强依赖性，B 族维生素产生的最佳pH6.5 左右[30]。在此过程中，叶酸含量无明显变化，不同菌株对叶酸含量影响的差异性较大，具体原因有待进一步研究。

2.3.4 植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉游离氨基酸含量的影响

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，其含量和种类常作为食品营养价值和风味的重要评价指标。通过对游离氨基酸含量的检测，结果如表6所示。

表6 小麦糊粉层粉发酵前后氨基酸含量Table 6 Content of amino acids in the powder of wheat aleurone layer before and after fermentation mg/g

由表6 可知，通过优化过后的发酵条件对小麦糊粉层进行发酵处理，其氨基酸总量和必需氨基酸含量相比发酵前分别提升了5.46% 和18.19%，其中，苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）含量与发酵前相比均显著提升（P＜0.05）。

氨基酸去向见图6。

图6 氨基酸去向Fig.6 Fates of amino acids

由图6 可知，蛋白质分解为多肽，在肽酶的作用下分解为Val、Leu、Phe，蛋白质分解主要由于发酵过程中酸度上升，糊粉层组分中内源性蛋白酶被激活导致的，Val、Leu 为支链氨基酸，Leu 能更快地分解、转化为葡萄糖，减少运动过程中肌肉损伤和延迟疲劳[31]，而Val 作为肌肉代谢和协调所必需，在保持身体氮平衡上具有重要的作用[32]，蛋白质分解导致Val、Leu 含量上升，这也与粗蛋白含量下降结果一致。Lys 和Thr 通过三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），由草酰乙酸分解转化而来。Ser 通过糖酵解途径，以3-磷酸甘油酸为碳骨架合成而来，作为一种功能性氨基酸，在调控机体免疫功能、抗氧化应激和治疗代谢疾病等方面发挥着重要的生物学作用[33]。Ile 作为动物重要的必需氨基酸，能够显著提高小肠的绒毛高度，促进肠道的吸收功能和屏障功能[34]。Phe 和Tyr 作为芳香族氨基酸，与发酵面团的风味密切相关，表明乳酸菌发酵能够显著提升食品的风味物质含量。此外，天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）经植物乳杆菌发酵后含量显著降低，这可能是由于发酵过程中微生物生长消耗以及发酵后期多种可挥发性酸形成。通过对氨基酸含量分析表明，植物乳杆菌发酵能够一定程度上提升小麦糊粉层的营养功能和感官风味。

3 结论

本研究以小麦糊粉层粉为原料，以植物乳杆菌JCW1149 为发酵剂进行酸面团发酵，以小麦糊粉层粉多酚含量为指标，通过单因素及响应面试验得出最佳的发酵条件为发酵时间22 h、发酵温度38 ℃、JCM1149接种量为1.4×107CFU/g，在此条件下测得的多酚含量为（2.31±0.01）mg/g，对今后糊粉层粉的生产应用具有参考意义。通过对比发酵前后营养物质含量发现，发酵后蛋白含量下降，可溶性膳食纤维含量提高，不溶性膳食纤维含量下降，总膳食纤维含量降低；多数矿物质含量明显上升，铁元素与钾元素含量略微降低，表明植物乳杆菌发酵对提升矿物质含量具有一定的促进作用。植物乳杆菌发酵处理能够明显提升维生素含量，促进维生素的转化，有效提高糊粉层粉的营养价值。对游离氨基酸含量进行测定，结果表明植物乳杆菌发酵能够促进粗蛋白分解，从而释放多种功能性氨基酸，且芳香族氨基酸含量明显提升，表明发酵处理对糊粉层食品的风味有一定提升。综上，植物乳杆菌发酵对小麦糊粉层粉的实际应用有一定促进作用，对于小麦制品的流变特性有一定程度的改良效果，且发酵后的糊粉层粉香气浓郁，为后续将糊粉层粉的加工及应用提供参考。