基于 γ-干扰素释放试验的麻风分枝杆菌感染筛查诊断

李艳艳 王 川 孙乐乐 潘 晴 王 娜 周桂芝 刘 红 张福仁

1山东第一医科大学附属皮肤病医院,山东济南,250022;2山东省皮肤病性病防治研究所,山东济南,250022

麻风是一种由麻风分枝杆菌感染易感人群导致的慢性肉芽肿性疾病,主要侵犯皮肤和周围神经,严重者可通过血液或淋巴系统播散[1］。根据机体对麻风菌免疫反应的强弱,麻风可大致分为五个类型,LL型：特异性Th1型细胞免疫弱或缺失,细菌指数高;TT型：特异性Th1型细胞免疫强,高IFN-γ分泌,低细菌指数;BT、BL、BB型为免疫不稳定型。根据皮损数目可将患者分为皮损少于5个的少菌型(PB,包括TT和BT型)和多于5个的多菌型(MB,包括LL、BL和BB型)。麻风仍是我国和WHO传染病防控的重点,对麻风患者进行早期筛查已成为防治麻风、消除麻风危害的重要手段[2］。

某些分枝杆菌在生长早中期分泌到胞外的一些蛋白,具有高度免疫原性和特异性,常作为分枝杆菌感染诊断和预防研究的重要靶抗原。6 kD早期分泌抗原(ESAT-6)和早期滤液蛋白-10(CFP-10)是来源于结核分枝杆菌的分泌蛋白,其能诱发特异性Th1应答,与细菌的毒力密切相关,可提供抗结核杆菌感染的保护性[3］。基于ESAT-6/CFP-10建立的两种商业化的检测技术T-SPOT.TB和QuantiFERON-Gold已在临床上广泛应用,通过γ-干扰素释放试验(Interferon-γ release assay,IGRA)对结核感染者进行有效诊断,且不受BCG预防接种的影响[4］。研究发现结核分枝杆菌ESAT-6和CFP-10与麻风分枝杆菌同源物之间有一定的同源性[5,6］。将结核分枝杆菌ESAT-6/CFP-10作为刺激性抗原,在麻风患者外周血及其单个核细胞(PBMCs)中进行检测,发现麻风杆菌来源的两种蛋白与结核分枝杆菌同源物之间存在完全免疫交叉反应。目前该研究缺乏多样本的数据支持,其性能还有待评估。

1 材料与方法

1.1 患者招募与病理组织样本的收集 对2019年1月至2022年10月期间在山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病与性病防治研究所)诊断为麻风的病例进行筛选纳入,共获得29份临床标本(包括血液和皮损组织),所有患者均根据病史、临床表现、皮肤涂片和组织学检查确定诊断,并对每例患者进行严格的Ridley-Jopling(R-J)分级(LL、BL、BB、BT和TT)(Kundu, 1979)。20份健康献血者的血液样本作为本研究的对照。所有患者均按照WHO指南进行联合化疗方案(MDT)的治疗。

1.2 酶联免疫斑点法检测抗原刺激后释放IFN-γ的效应T细胞 采用I-SPOT-TB试剂盒进行检测。将PBMCs解冻、洗涤并在培养箱(37℃, 5% CO2)中孵育过夜。将96孔微孔板上依次设置空白对照组、PHA对照组和测定组,培养液中分别加入50 μL AIM-V、50 μL PHA和50 μL抗原试剂,设置3个复孔。每孔加入100 μL含3.0×106cells/mL的PBMCs,置于恒温培养箱(37℃, 5%CO2)中孵育16～20 h。洗板后,加入标记抗体,于2℃～8℃孵育60 min。重复洗板操作,加入50 μL显色底物溶液,暗室室温下反应7 min,加入去离子水终止反应,使用放大镜进行斑点计数。

1.3 qPCR方法 qPCR引物由NCBI网站设计,并在UCSC数据库(http：//genome.ucsc.edu/)中进行验证。在实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher, USA)上使用Taqman探针方法完成qPCR反应。总反应体系为20 μL,包括引物探针混合物、去离子水、正反向引物和DNA。qPCR扩增条件：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,进行40个循环。完成40个循环扩增后,对扩增结果进行分析：(1)Ct值≥37为阴性;(2)Ct值<37判定为阳性。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software Inc, CA, SanDiego, USA)进行统计学分析。组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。所有检验均为双侧,P<0.05认为差异有统计学意义。

1.5 伦理声明 本研究经山东省皮肤病性病防治研究所审查和伦理委员会批准。在采集血液和组织之前获得了所有患者和健康志愿者的知情同意。

2 结果

2.1 MB和PB患者IFN-γ激活程度的比较分析 使用结核分枝杆菌的重组蛋白rESAT6-CFP10作为刺激性抗原,在29例麻风患者和20名正常对照的PBMCs中应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测释放IFN-γ的效应T细胞频数(图1a)。MB和PB患者IFN-γ的激活程度无统计学差异(图1b)。根据实验情况,包括1例麻风患者和2例正常对照存在高IFN-γ分泌情况,1例麻风患者细胞失活,故从本研究中剔除。

N：空白对照孔;P：植物血凝素孔;T：测试培养孔IGRA检测患者PBMCs中IFN-γ的激活程度

MB和PB患者IGRA阳性率的比较分析 根据试剂盒给定的阳性标准,确定各组的阳性患者,16例MB患者中6例阳性,IGRA的检出率为 37.5%;11例PB患者中5例阳性,检出率为45.45%。比较两组IGRA阳性率,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 27例麻风患者的IGRA检测结果

IGRA联合qPCR对PB患者的诊断价值 12例MB患者进行了qPCR检测,阳性率为100%。8例PB患者进行了qPCR检测,阳性率为25%。联合IGRA结果进行分析,37.5%(3/8)的PB患者qPCR阴性,IGRA阳性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA阴性,qPCR阳性;IGRA阳性或qPCR阳性患者达75%(6/8)。见表2。两种筛查方法的结合可能有利于临床表现不典型的PB患者的诊断。

表2 IGRA与qPCR在27例麻风患者中诊断效能的比较分析 例(%)

3 讨论

麻风是由麻风分枝杆菌引起的一种慢性传染病,主要影响皮肤和周围神经。虽然联合化疗药物治疗降低了全球麻风的患病率,但麻风仍然是一个公共卫生问题[7］。该病的诊断主要依靠临床表现和组织病理学检查。然而,由于麻风的临床特征和组织病理学复杂,且PB患者以单纯神经瘤和少数皮肤病变为主,涂片较难检出麻风分枝杆菌,使得该类患者的诊断和鉴别诊断具有挑战性,尤其在发病早期[8］。因此,有必要采用更灵敏、可靠、准确的方法来诊断PB病例。研究证实,麻风分枝杆菌抗原刺激诱导的IFN-γ分泌在PB患者中获得了比MB患者更高的阳性反应率[9］。多项研究评估了麻风分枝杆菌不同抗原组合的检测价值,如麻风分枝杆菌重组蛋白(rML),包括46f+LID-1、ML0276+LID-1、ML2055+ML1632+ML2044、ML0276+46f、ML2055+LID-1等[10］,通过测定感染患者外周血上清液中IFN-γ水平来探索以重组蛋白为刺激性抗原的免疫应答,但这种方法识别PB患者的潜力有限[11］。

既往研究中,基于结核分枝杆菌ESAT-6、CFP-10蛋白和麻风分枝杆菌同源物之间的同源性关系,以结核分枝杆菌rESAT6-CFP10蛋白为刺激性抗原进行全血的IGRA试验中,50%(5/10)的PB患者呈阳性,40例MB患者均为阴性[12］。在麻风患者PBMCs中进行的研究同样证实了麻风杆菌的两种蛋白与结核杆菌同源物之间存在免疫交叉反应。以CFP-10为刺激抗原,在3例麻风患者中特异性T细胞斑点数为36(164)、42(76)、54(280)[13］;以ESAT-6为刺激抗原,在4例麻风患者中斑点数为88(164)、68(76)、220(280)、252(184)[5］。

为进一步评价IGRA的诊断价值,补充麻风的筛查手段,我们开展了该研究。本研究发现使用结核分枝杆菌rESAT6-CFP10刺激麻风患者的PBMCs后,MB患者的检出率为37.5%(6/16),PB患者的检出率为45.45%(5/11),结果大致符合该蛋白在结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌间的同源性关系。PB患者的IFN-γ激活程度及阳性率略高于MB患者,但差异无统计学意义。MB患者常存在免疫功能低下,细胞免疫反应弱,表现为IFN-γ分泌水平低,皮肤涂片中麻风杆菌数量多,即IGRA敏感性低的原因。在结核患者中也发现,免疫功能正常的患者相比免疫功能低下者对IGRA检测的敏感性更高。由于实验操作方法及人为因素的异质性,MB患者的IFN-γ水平在各项研究中不全一致,与其他研究相比,本研究中的数据(阳性率37.5%)偏高,不排除受实验操作因素及样本量的影响。

分子检测,如qPCR,已被证明是诊断PB麻风的强大诊断工具,该技术灵敏度高,对于镜检阴性患者的早期诊断或组织病理学不确定病变的鉴别诊断非常重要。在皮肤活检中,80%以上的MB患者和30%～40% PB患者的皮肤组织样本能检出麻风杆菌DNA。在一系列可能的基因靶点中,麻风杆菌特异元件RLEP、16srRNA、folP、gyrA和rpoB被确定为最适合用于诊断[14］,结合这些基因开发麻风杆菌试验可以加强早期麻风病例的诊断。本研究以RLEP为靶基因进行皮损组织的qPCR检测,MB患者中的阳性率为100%(12/12),PB患者中为25%(2/8)。MB患者中,皮损组织qPCR的阳性率明显高于血液IGRA的阳性率;PB患者的qPCR阳性率则低于血液IGRA。将qPCR与IGRA联合分析发现,37.5%(3/8)的PB患者qPCR阴性,IGRA阳性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA阴性,qPCR阳性;IGRA阳性或qPCR阳性的PB患者达75%(6/8),两种检测手段在一定程度上能够相互补充,可能是早期发现PB患者的有效联合检测手段。

综合既往研究和本研究的结果,可认为IGRA在PB患者中的敏感性尚可,在MB患者中异质性较大。特异性不高,使用该方法不能将麻风与结核分枝杆菌等基因组携带RD-1区的分枝杆菌引起的疾病相鉴别。针对麻风分枝杆菌特异性抗原的IGRA能提高该检测的特异性,更好地将麻风与其他分枝杆菌疾病鉴别开来。

综上,本研究发现IGRA对麻风分枝杆菌感染的诊断价值值得商榷,但为该感染的诊断提供了思路,阳性结果提示麻风杆菌感染的可能性,具体应结合患者临床表现、接触史或其他实验室检查进行综合诊断。IGRA联合qPCR可能是早期发现和筛查麻风杆菌的辅助检测方法。基于γ-干扰素释放试验的应用,IFN-γ在预测早期麻风、结节性红斑反应和监测治疗反应中的价值有待进一步研究。此外,本研究的样本量较小,可能会造成一定的误差,未来需要加大样本量进一步研究。