基于多成分定量及化学计量学的4 种郁金特征性成分识别与质量评价

蓝振威，杨小露，孟 江*，季 德，陆兔林，王淑美

1.广东药科大学中药学院，国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东高校（省）中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006

2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

郁金CurcumaeRadix为姜科植物温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling、姜黄CurcumalongaL.、广西莪术CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 或蓬莪术CurcumaphaeocaulisVal.的干燥块根。前两者分别习称“温郁金”和“黄丝郁金”，其余按性状不同习称“桂郁金”或“绿丝郁金”。郁金具有利胆退黄、行气解郁、活血止痛、清心凉血之功，常用于治疗妇女痛经、癫痫发狂、黄疸尿赤、胸胁刺痛、乳房胀痛等症[1]。郁金主要活性成分为姜黄素类（去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、姜黄素）和挥发油类成分（吉马酮、莪术二酮、莪术烯、β-榄香烯、莪术烯醇、异莪术烯醇、呋喃二烯酮、莪术醇、呋喃二烯）[2]。目前郁金的质量分析主要依靠GC 或HPLC测量单一挥发油类或姜黄素类成分[3-4]，很少将其质量与疗效联系，同时也没有量化的综合评价指标，难以体现不同品种间整体质量与药效区别[5-6]。本实验采用HPLC 法测定了4 种郁金共20 批样品中的12 个主要活性成分含量，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares-discriminate analysis，OPLS-DA），结合化合物的药理作用，对郁金进行了全面的分析。PCA 通过建立新的更少的变量来体现整体变量的变化规律[7]，OPLS-DA 可以过滤与样品分类不相干的变量，更好地寻找差异标志物[8]。通过以上方法了解了不同品种郁金的优劣，为综合评价郁金质量提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）（SPD-20A 检测器，CTO-10ASVP 柱温箱，LC solution 色谱工作站），XB-C18色谱柱［月旭科技（上海）股份有限公司］，RE-2000B 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），A1-1000S 水流抽气泵（日本EYELA 公司），十万分之一电子天平（CPA225D，德国Sartorius 公司）。

1.2 试药

莪术烯醇（批号E-003-171216）、莪术烯（批号E-008-161216），以上对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司； 异莪术烯醇（ 批号CHB170822）、呋喃二烯（批号CHB151009）、呋喃二烯酮（批号 CHB170624）、姜黄素（批号CHB160901）、莪术醇（批号CHB150914）、β-榄香烯（批号CHB150901），以上对照品均购自成都克洛玛生物科技有限公司；双去甲氧基姜黄素（批号yz15121603）、去甲氧基姜黄素（批号yz16032302）、莪术二酮（批号yz16070804），吉马酮对照品（批号yz16012603），以上对照品均购自南京源植生物科技有限公司，所有对照品质量分数均≥95%。乙腈、甲醇（色谱纯），磷酸（上海阿拉丁生物科技有限公司），水为屈臣氏蒸馏水。

郁金药材分别来自中国广西、浙江、四川和缅甸，共计20 批，经广东药科大学刘基柱副教授鉴定为姜科植物蓬莪术C.phaeocaulisVal.、广西莪术C.kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 或温郁金C.wenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥块茎。详细产地信息见表1。

表1 4 种郁金详细产地信息Table 1 Detail origin information of four kinds of Curcumae Radix

2 方法与结果

2.1 色谱条件

UltimateTM XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，30% A；5～35 min，30%～60% A；35～39 min，60%～68% A；39～43 min，68% A；43～49 min，68%～80% B；49～69 min，80%～95% A；69～79 min，95% A）。体积流量0.2 mL/min，柱温25 ℃。进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 对照品 (A) 和样品 (B) 的HPLC 特征图谱Fig.1 HPLC characteristics of reference (A) and samples (B)

在定量分析中，根据各化合物的全波长扫描确定检测波长，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素在415 nm 处有较好的响应，其余化合物在210 nm 处响应较好。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制 分别精密称取莪术醇、呋喃二稀、β-榄香烯、莪术烯醇、莪术烯、莪术二酮、呋喃二烯酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、吉马酮和异莪术烯醇各对照品适量，用甲醇溶解并配成质量浓度分别为5.50、10.87、3.45、3.74、7.50、7.22、6.92、0.37、0.24、0.26、2.05、0.316 g/L 的混合对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 取样品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入8 mL 甲醇，密塞，称定质量，常温下超声提取（功率5 kW、频率40 kHz）45 min，放至室温，加甲醇补充质量，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围、检测限和定量限 精密量取“2.2.1”项下的混合对照品储备液，用甲醇稀释成不同质量浓度的系列对照品溶液，精密吸取10 μL 按“2.1”项下色谱条件进行测定。以对照品母液中12个成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），利用加权小二乘法进行线性回归，建立标准曲线见表。同时测定各个成分的检测限（S/N＝3）和定量限（S/N＝10），结果见表2。

表2 12 种化学成分的回归方程及线性范围Table 2 Regression equation and linear range of 12 chemical constituents

2.3.2 精密度试验 取同一份供试品（HSYJ1）照“2.2.2”项下制备供试品，按“2.1”下色谱条件连续进样6 次，记录待测成分峰面积，计算RSD。12 种待测成分含量日内精密度RSD 均小于2.9%，日间精密度RSD 均小于2.7%，表明方法的精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一份供试品（HSYJ1）6份，按照“2.2.2”项下制备供试液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果显示12 种待测成分峰面积的RSD 均小于2.8%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品（HSYJ1）溶液，分别于制样后0、2、4、8、12、18、24、36、48 h 进行分析，记录待测成分峰面积。结果显示12种待测成分封面积的RSD 值均小于2.86%，表明样品在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的郁金药材粉末6 份，每份约0.5 g，置具塞锥形瓶中，按照1∶1 比例分别精密加入等量对照品溶液，照“2.2.2”项下制备供试液，进行分析，计算各待测成分的回收率和RSD 值。12 种成分的平均回收率分别为95.38%～103.26%，RSD 均小于3.0%。

2.4 含量测定

精密称取4 种郁金粉末各5 批，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”下色谱条件进行测定。测定各成分峰面积，使用外标法计算样品含量，结果见表3。

表3 不同来源郁金含量测定结果Table 3 Results of determination of Curcumae Radix from different sources

2.5 PCA 结果

2.5.1 数据处理结果 为了消除不同权重对数据分析的影响，通过SPSS 软件对数据进行标准化预处理后进行PCA，计算相关矩阵的特征值和特征向量[7]，得到特征值的方差贡献，计算得到的前3 个因子的累积方差贡献率为90.476%＞80%，说明3 个新变量可对原始变量的90.476%进行解释，见表4。

表4 主成分的特征值与贡献率Table 4 Characteristic value and contribution rate of principal component

2.5.2 因子载荷矩阵分析 根据特征值的方差贡献率结果，选取3 个主成分对整体样品进行分析，结果见表5，第1 主成分（解释整体样品50.97%）影响较大的因子有双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、β-榄香烯、莪术烯醇、莪术烯和异莪术烯醇，因子载荷均在0.8 以上，是4 种郁金种间差异的重要来源；第2 主成分对整体样品解释了27.07%，主要来自莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和莪术二酮的影响，其中吉马酮和莪术二酮是郁金重要的活性成分，因子载荷均大于0.9，是该方向上4种郁金的潜在差异标志物；第3 主成分占总解释程度的12.44%，主要来自莪术醇和呋喃二烯酮，是一个影响较小的分量。

表5 郁金中各成分因子载荷矩阵Table 5 Factor loading matrix of each component in Curcumae Radix

通过每个因子的得分系数矩阵，经过凯撒正态化最大方差法旋转后，得到3 个新变量的得分表达式。

F1＝0.166X双去甲氧基姜黄素＋0.166X去甲氧基姜黄素＋0.166X姜黄素－0.018X莪术醇－0.014X吉马酮－0.002X呋喃二烯＋0.131Xβ-榄香烯＋0.146X莪术烯醇＋0.163X莪术烯＋0.04X莪术二酮＋0.123X异莪术烯醇－0.031X呋喃二烯酮

F2＝−0.001X双去甲氧基姜黄素＋0.001X去甲氧基姜黄素－0.001X姜黄素＋0.180X莪术醇＋0.295X吉马酮＋0.289X呋喃二烯＋0.071Xβ-榄香烯－0.017X莪术烯醇－0.006X莪术烯＋0.297X莪术二酮－0.018X异莪术烯醇－0.103X呋喃二烯酮

F3＝−0.086X双去甲氧基姜黄素－0.081X去甲氧基姜黄素－0.089X姜黄素＋0.460X莪术醇＋0.039X吉马酮－0.087X呋喃二烯＋0.166Xβ-榄香烯－0.113X莪术烯醇－0.001X莪术烯－0.084X莪术二酮＋0.330X异莪术烯醇＋0.519X呋喃二烯酮

得到的各因子表达式以其对应的方差贡献率作为权重，对3 个主成分进行线性加权，得到了1 个全面的评价函数：F＝0.509 68F1＋0.270 70F2＋0.124 38F3。

2.5.3 郁金药材质量评价标准的建立 在郁金中，姜黄素类和挥发油类是2 种重要的药效成分，不同的化合物具有不同的药效，基于治疗效果和全面评价函数对4 种郁金进行了质量评价：莪术醇、莪术二酮和β-榄香烯可以改善血液粘稠度，减少血小板聚集[9-10]，姜黄素能通过调节血管紧张素酶与血管紧张素Ⅱ受体的双重作用，抑制心肌纤维化，改善心功能[11-12]，因此，将这些化合物的总量作为心血管保护作用效果对药材进行排名，计排名A；莪术稀醇[13]、莪术二酮、吉马酮[14]、莪术醇和姜黄素具有抗炎镇痛作用[15-16]，5 种成分作为抗炎镇痛的代表性化合物进行排名，计排名B；抗肿瘤是郁金的重要作用之一，研究表明，这一疗效的实现主要与β-榄香烯、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和姜黄素类化合物有关[9-18]，其总量的排名代表药材抗肿瘤活性，计排名C；将具有抗病毒作用的莪术醇[9]、莪术二酮[10]、吉马酮[14]和姜黄素类化合物[11]总量计排名D，用以比较不同种郁金的抗病毒作用。最后通过全面评价函数对药材进行全面评价，计排名E。在计算总量之前首先对数据进行归一化处理，结果见表6。

表6 20 批郁金药材的综合得分与排名Table 6 Comprehensive score and ranking of 20 batches of Curcumae Radix

从5 个排名整体上看，对应不用的疗效，4 种郁金的优劣有明显的趋势，从优到劣，黄丝郁金＞温郁金＞绿丝郁金＞桂郁金。从排名C 和E 可以看出，温郁金和绿丝郁金有个别的交错。从药效成分的含量来看，黄丝郁金和温郁金各成分含量高，而桂丝郁金相对较低；同一郁金品种内综合评价方程得到的结果与A、B、C、D 的排名基本一致，只有少数几个样品变化较大，如HSYJ2 的综合评价为5批黄丝郁金中最差，但是在前4 个排名中为1、2，而本排名3、4 的HSYJ4 其综合排名为1；WYJ3前4 个排名中的均值为11.25，但是综合排名降至17，这是因为PCA 从新变量的角度给予了不同化合物全新的权重，一些潜在的具有微弱作用的化合物被纳入评价方程，郁金之间的优劣得到了进一步的全面评价，所以某些批次的产品排名发生了较大变化；综合评价方程对郁金种间的整体评价与以药效成分进行评价的结果是一致的，说明基于郁金主要化学成分建立的该评价模式虽然重新给予了12 种化合物含量不同的贡献度，但是这种差异仍然能体现其药效成分的差异。

2.6 OPLS-DA 结果

为了进一步了解4 种郁金药材的重要差异化合物，采用OPLS-DA 法对成分进行分析，与偏最小二乘法相比，它能提供更多的解释性和减少结果误差。本实验将20 批样品的12 个成分标准化数据导入SIMCA-p 13.0 软件中，进行正交偏最小二乘分析，得到的模型结果：质量参数R2X为0.874，R2Y为0.693，Q2为0.626。模型的得分图（图2-A）中，黄丝郁金和温郁金是区分较大的2组，而桂郁金和绿丝郁金重叠性很大，难以区分。计算了变量的重要性投影（variable importance projection，VIP）值，图2-B 用红色表示了8 个对分类有统计学意义的分量（VIP 值＞1），其影响能力从大到小依次是呋喃二烯酮＞莪术二酮＞吉马酮＞呋喃二烯＞莪术烯＞姜黄素类化合物。可见，莪术二酮、吉马酮和呋喃二烯酮具有分类上较强的影响力，莪术二酮和吉马酮同时是保护心血管，抗肿瘤和抗炎镇痛作用的共同化合物，既具有对郁金药材的区分能力，又具有质量评价的潜力，是很好的特征标志物。

图2 OPLS-DA 得分散点 (A) 和VIP (B) 图Fig.2 OPLS-DA score plot (A) and VIP plot (B)

进而对模型整体的回归系数进行分析（图3），该回归系数解释了每一个成分变量对该品种郁金的影响，可见在黄丝郁金中，姜黄素类化合物、β-榄香烯和异莪术烯醇是其独特的优势成分，其中姜黄素类化合物的高表达印证了中国药典中对黄丝郁金“气芳香，味辛辣”的描述，同时也是各种药理作用重要的药效成分；在温郁金中，吉马酮、呋喃二烯和莪术二酮是该品种含量比其他3 种郁金更多的化合物，其中吉马酮和莪术二酮的系数为正，其余3 种郁金在2 种成分上的系数为负，可作为该品种的特征性成分，并且该品种姜黄素类化合物的含量仅次于黄丝郁金，对应了该品种破血力较强的特点；绿丝郁金中呋喃二烯酮的含量远高于其他品种，是区别于其他郁金品种的特征化合物，据报道呋喃二烯酮具有一定的抗癌活性[19]，当以该化合物为目的使用郁金时，绿丝郁金的这种特征能在郁金的合理应用中给予指导；桂郁金在大多数种成分的含量上没有很好的表现，但是其中作为最有效的成分之一的莪术醇含量显著[20]，因此该品种也具有其独特的优势，即当需要突出莪术醇的活性使用郁金时，桂郁金是很好的选择，然而由于其莪术醇含量与黄丝郁金相似，故桂郁金没有明显的特征性成分。综上所述，郁金种间重要的性差异化合物为莪术二酮和吉马酮，4 种郁金各自的特征性成分为：黄丝郁金中的姜黄素类化合物，莪术醇，β-榄香烯和异莪术烯醇；温郁金中的吉马酮、呋喃二烯和莪术二酮；绿丝郁金中的呋喃二烯和呋喃二烯酮；桂郁金中的莪术醇。

图3 OPLS-DA 模型整体回归系数图Fig.3 Integral regression coefficient diagram of OPLS-DA

3 讨论

郁金作为牛黄清心丸、牛黄降压片和抗病毒口服液等多种经典制剂的原料药，市场需求很大，但是郁金的品种较多，含有多种药效成分，且种间差异较大，通过测定一个或几个指标难以对郁金进行科学的区分的和全面的质量评价，尤其在中药制剂中难以确定以何种郁金作为原材料，容易造成郁金单品和成方制剂的药效不一致。因此，建立能区分和反映不同种郁金活性成分含量的综合评价模式，并探究其各自的特征是郁金质量评价与应用的关键性问题。

本实验采用HPLC 法建立了郁金12 种药效成分含量测定方法，并应用化学计量学方法建立综合评价模式，识别郁金的特征性成分。通过PCA 选取了最能解释原始变量的3 个新变量，在无监督区分的基础上建立了综合评价方程，并以各种活性成分的含量为指标，验证该综合评价方程能准确反应整体质量，得出4 种郁金质量排序为黄丝郁金＞温郁金＞绿丝郁金＞桂郁金。但是整体的排序并不能反应4 种郁金各自的特点，需要进一步发掘各品种郁金的特征性成分，为合理区分和使用不同品种郁金提供依据。继而采用OPLS-DA 方法寻找和识别了4 种郁金种间的质量差异标志物，呋喃二烯酮、莪术二酮和吉马酮，当以区分不同种郁金为目的，呋喃二烯酮因具有最大的VIP 值，故为最佳选择；当以用药的成分含量为指标，莪术二酮和吉马酮作为郁金中活性显著的成分，是很好的质量差异标志物。应用建立的整体回归系数寻找4 种郁金各自的特征标志物，发现姜黄素类化合物，β-榄香烯和异莪术烯醇可作为黄丝郁金的特征标志物；吉马酮和莪术二酮可作为温郁金的特征标志物；呋喃二烯酮可作为绿丝郁金的特征标志物；桂郁金虽然莪术醇含量较多，但是该成分含量与黄丝郁金相似，故不建议将莪术醇作为该品种的特征标志物。本实验建立的综合质量评价模式及不同种属郁金的特征成分为郁金资源质量控制和临床应用提供了科学的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突