紫胡萝卜复合发酵饮料的研制及其挥发性风味物质分析

袁辛锐，杨其长，王 芳，林致通,2,

（1.中国农业科学院都市农业研究所，四川成都 610065；2.四川天味食品集团股份有限公司，四川成都 610200）

羽衣甘蓝是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种[1]，一种高营养、低热量、高膳食纤维的蔬菜，被称为“超级食物”[2]。其富含多种维生素和矿物质，尤其Ca、Fe、P 含量突出[3]，含有异硫氰酸酯、多酚、类胡萝卜素等生物活性成分，有助于抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]。冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）别名冰叶日中花、冰草，属番杏科（Aizoaceae）[7]，叶面底部和茎上附着大量包含盐类的细胞[8]，自身带微咸味，口感清脆，富含矿物质和维生素，黄酮类化合物含量也较高[9-10]，具有保护肝脏、抗痘、抗病毒的功效[11]。紫胡萝卜由于富含花青素而呈现紫色，花青素是迄今为止发现的抗氧化性较强的天然活性物质之一，属于多酚类化合物，具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎功效、改善视力[12]等功效。

目前对羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜的研究多集中在种植技术和品种鉴定上，除鲜食外，其食用价值未被充分开发利用[13]。近年来发酵果蔬饮品受到消费者的喜爱[14]，因为蔬菜水果经发酵后，不仅营养吸收效率得到显著提高[13]，同时，果蔬饮料含大量益生菌，能够调节肠道菌群[15]，维持肠道健康[16-17]。对于发酵饮料的研究也逐渐深入，比如王紫琳等[18]、王鑫等[19]分别优化了雪莲果、清涧红枣发酵饮料的发酵参数，但对于蔬菜发酵饮料，尤其是以羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜的复合饮料发酵工艺鲜有研究。因此，亟需对此开展深加工技术，提升产品附加值。

本研究以羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜为主要原料，以安琪乳酸菌为发酵剂，制备紫胡萝卜复合发酵饮料，以总糖、总酸、乳酸菌活菌数及感官评分为指标，利用单因素实验和正交试验，研究了紫胡萝卜复合发酵饮料的最佳工艺参数，并探讨了发酵饮料的挥发性风味物质，旨在酿造一款口感佳、营养丰富的发酵饮料，为蔬菜发酵饮料的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冰菜、羽衣甘蓝、紫胡萝卜、白砂糖 购自超市；乳酸菌 安琪酵母股份有限公司；盐酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸铜、氯化钠、葡萄糖 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；MRS 培养基 北京索莱宝科技有限公司。

MJ-BL1206A 破壁机、SN2105T 电磁炉 美的集团有限公司；HWS-250 恒温培养箱 绍兴苏珀仪器有限公司；XHF-D-XZ 高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；TD50002A 电子天平 宁波市鄞州华丰仪器厂；SW-CJ-2FD 超净工作台 上海尚道仪器制造有限公司；QP2010Ultra 气相色谱-质谱仪（Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫胡萝卜复合发酵饮料的制备

1.2.1.1 工艺流程 原料→清洗→漂烫→打浆→过滤→调配→均质→煮沸杀菌→冷却→接种→发酵→成品

1.2.1.2 操作要点 漂烫：将清洗干净的羽衣甘蓝进行漂烫，漂烫温度100 ℃，时间1 min，料液比1:30（g:mL）。

打浆：将处理好的羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜分别以料液比1:2 的比例与纯净水混合后打浆。

过滤：将蔬菜浆过100 目纱布得到滤液。

调配：将羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜三种蔬菜汁以质量比5:5:1 混合，加入蔬菜汁总质量7%的糖并混合均匀。

均质：常温下用4000 r/min 均质1 min。

杀菌：将混合液加热，直至煮沸。

接种：待混合液冷却到40 ℃，按7‰的比例加入发酵剂，并搅拌均匀。

发酵：在40 ℃恒温条件下发酵36 h 后结束发酵。

1.2.2 单因素实验 根据前期实验结果选取糖添加量、乳酸菌接种量、发酵温度和发酵时间来进行单因素实验。

1.2.2.1 糖添加量 设定糖添加量分别为4%、5%、6%、7%、8%，接种量为7‰，发酵温度为40 ℃，发酵时间为36 h 进行发酵，研究不同糖添加量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响。

1.2.2.2 乳酸菌接种量 设定乳酸菌接种量分别为4‰、5‰、6‰、7‰、8‰，糖添加量为7%，发酵温度为40 ℃，发酵时间为36 h 进行发酵，研究不同乳酸菌接种量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响。

1.2.2.3 发酵温度 设定发酵温度分别为38、39、40、41、42 ℃，糖添加量为7%，接种量为7‰，发酵时间为36 h 进行发酵，研究不同发酵温度对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响。

1.2.2.4 发酵时间 设定发酵时间分别为30、32、34、36、38 h，糖添加量为7%，乳酸菌接种量为7‰，发酵温度为40 ℃进行发酵，研究不同发酵时间对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响。

1.2.3 正交试验 在单因素实验的基础上，选择对实验结果影响较大的糖添加量（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4 个因素进行L9（34）正交优化试验。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels for orthogonal experiments

1.2.4 理化指标的测定 总糖的测定：按照GB 5009.7-2016 采用滴定法，还原糖以葡萄糖计。总酸的测定：按照GB/T 12293-90 采用滴定法，总酸以乳酸计。膳食纤维的测定：按照GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》方法测定。乳酸菌数：MRS 培养基平板计数法。

1.2.5 挥发性风味物质的测定 参照杨定宽等[20]的方法进行测定。

1.2.5.1 样品的前处理 将3 mL 样品加入顶空瓶中，于60 ℃条件下萃取55 min。

1.2.5.2 GC 条件 色谱柱：SH-Rtx-Wax 强极性毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；45 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升温至180 ℃，保持3 min，接着以12 ℃升温至220 ℃，保持3 min；载气（He）流速1.67 mL/min，压力19.0 kPa；分流比10:1。

1.2.5.3 MS 条件 质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度200 ℃；溶剂延迟：3 min；增益系数：1.16；质量扫描范围m/z 35～500。

1.2.6 感官评价 参照葛永辉等[21]的方法制定发酵饮料的感官评分标准，产品在4 ℃下贮藏24 h，请10 位专业人员根据产品的色泽、澄清度、香气、滋味进行评分，满分100 分，评分标准见表2。

表2 紫胡萝卜复合发酵饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of purple carrot compound fermented beverage

1.3 数据处理

所有试验重复3 次，结果均采用平均值±标准偏差的表示方法。数据统计使用Excel 2010 软件进行，采用SPSS 25.0 软件进行数据显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 糖添加量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响 糖是乳酸菌生长代谢可利用的底物，乳酸菌可通过转化酶将糖水解为葡萄糖和果糖，从而利用这种碳源[22]。如表3 所示，随着糖添加量的增加，总糖含量逐渐上升，膳食纤维含量无明显差异，总酸含量先升高后趋于稳定，活菌数和感官评分先升高后降低。发酵过程中饮料中的乳酸不断积累使总酸含量大量增加[23]。糖添加量为4%～5%时，添加量较低，不足以为微生物生长增殖提供充足的能量，导致部分微生物的死亡[24-25]，从而影响了活菌数及其产酸能力，因此总酸含量、活菌数和感官评分均较低。糖添加量为5%～7%时，乳酸菌大量增殖，活菌数和总酸含量上升，活菌数在7%时达到最大值；糖添加量为7%～8%时，添加量过多，饮料的渗透压增大，抑制了乳酸菌的生长和代谢，从而影响乳酸的继续产生[26]。糖添加量对饮料的感官评分影响重大，添加量过低会导致在发酵时间内无法形成特殊的发酵风味，导致蔬菜本身的味道过重；添加量过高则会因为甜度过高，掩盖了发酵饮料的特殊风味；在添加量为7%时，饮料的糖酸比适宜，感官评分最高。因此，紫胡萝卜复合发酵饮料的适宜糖添加量为7%。

表3 糖添加量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响Table 3 Effects of sugar addition on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.2 接种量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响

如表4 所示，随着接种量的增加，总酸、活菌数逐渐升高，总糖持续减少，感官评分先升高后降低，膳食纤维含量无明显变化，说明膳食纤维并非由微生物发酵获得。当接种量为4‰时，由于乳酸菌含量较低，产酸量较低，饮料风味物质积累少，糖消耗量低、总糖含量较高导致整体感官偏甜且有异味，因此感官评分也较低。当接种量为5‰～6‰时，饮料中的总酸逐渐上升，总糖含量逐渐降低，说明在一定的接种量下，总酸含量与接种量呈正相关，总糖含量与接种量呈负相关。当接种量在7‰～8‰时，饮料的总酸上升趋势不明显，活菌数持续增加，但感官评分稍有降低，在接种量7‰时达到最高。这是由于乳酸菌是发酵饮料中的优势菌种，适宜的接种量使发酵液充分发酵[27]，同时乳酸菌能够通过降低pH 和提高CO2水平来减少杂菌的干扰[28]，保证了饮料的良好口感；但当接种量过大时，营养物质消耗过快，同时产生醇类、醛类等刺激性气味，从而影响饮料的口感[29]。当接种量为7‰时，酸度适中，总糖较低，活菌数较高，感官评分最高。因此，紫胡萝卜复合发酵饮料的适宜接种量为7‰。

表4 乳酸菌接种量对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响Table 4 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.3 发酵温度对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响 如表5 所示，随着发酵温度的增加，饮料中的膳食纤维含量变化不明显，总酸含量和活菌数呈现增加趋势，总糖含量大幅度降低，感官评分先增加后减少。发酵温度过高或过低都会影响菌种的生长代谢。当发酵温度为38～39℃时，低于微生物的适宜发酵温度时，微生物细胞内酶活下降，影响产酸能力和发酵速度，不利于乳酸菌的生长，导致总酸含量、活菌数及感官评价较低[30-31]；当温度为41～42℃时，高温会抑制菌体生长代谢甚至导致菌种死亡，使杂菌污染的概率升高。此外，高温胁迫使乳酸菌发酵能力被抑制[32]，风味物质的积累减少，同时高温会导致发酵液损失更多的芳香挥发性物质[33]，导致感官评分较差。因此发酵饮料最适发酵温度为41 ℃，在此温度下乳酸菌活菌数较高，感官评分最高。

表5 发酵温度对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响Table 5 Effects of fermentation temperature on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.1.4 发酵时间对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响 从表6 可看出，总糖随着发酵时间的延长逐渐减少，总酸逐渐增加，活菌数先增加后趋于稳定，膳食纤维含量无明显变化，感官评分先增大后略微降低。有研究表明，在适宜接种量下，随着发酵时间的增加，乳酸菌活菌数增加趋势先缓慢后快速，最后趋于稳定[34]。如表6 所示，在30～32 h 区间活菌数增加较慢，32～36 h 区间增速上升，而36～38 h 活菌数增加速度缓慢，在38 h 时活菌数最高。其原因可能是32 h 前为调整期，乳酸菌为适应环境，主要活动为增殖，产酸少，风味不佳，感官评分低；32～36 h 区间为对数期，菌体生长迅速，代谢加强，总酸含量逐步升高；36～38 h 区间为成熟期，菌体总数稳定，一定时间内烯烃物质（不良风味来源）减少，有机酸、氨基酸和各种芳香族化合物生成[35]，使得总酸和风味物质积累较多，但发酵时间过长不良风味物质积累，产酸过多，导致感官评分下降。在当发酵时间为36 h 时，感官评分最高，饮料风味协调，活菌数也较高。因此，饮料的最佳发酵时间为36 h。

表6 发酵时间对紫胡萝卜复合发酵饮料品质的影响Table 6 Effects of fermentation time on the quality of purple carrot compound fermented beverage

2.2 正交试验

通过单因素实验，选择糖添加量（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）作为考察因素，以感官评分作为评价指标，进行4 因素3 水平的正交试验，试验结果及方差分析见表7 和表8。

表7 紫胡萝卜复合发酵饮料发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of purple carrot compound fermented beverage

表8 正交试验结果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表7 极差分析结果可知，4 种因素对紫胡萝卜复合发酵饮料的感官评分影响的强弱顺序依次为：发酵温度＞糖添加量＞发酵时间＞乳酸菌接种量。由表8方差分析结果可知，糖添加量和发酵温度对紫胡萝卜复合发酵饮料的感官评分的影响极显著（P＜0.01），发酵时间也对其影响显著（P＜0.05），但乳酸菌接种量对其的影响不显著（P＞0.05）。

实验结果表明紫胡萝卜复合发酵饮料的最优发酵条件为A2B1C3D3，即糖添加量7%，乳酸菌接种量5‰，发酵温度41 ℃、发酵时间38 h，但正交试验中未发现有此组合，对该组合进行验证，验证所得总糖含量0.21 g/L，总酸含量0.38 g/L，膳食纤维含量0.41 g/L，活菌数7.42×107CFU/g，感官评分最高为93.3 分。

2.3 挥发性风味物质的组成及含量分析

由表9 可知，紫胡萝卜复合发酵饮料中，检测出71 种挥发性风味物质。包括22 种醇类、16 种酮类、15 种醛类、8 种酯类、3 种酸类，以及其他化合物7 种。含量最高的是酮类化合物，为32.24%，其次是醛类化合物，为31.61%，然后是醇类化合物、酸类化合物、其他化合物及酯类化合物，其分别为16.27%、14.09%、3.36%、2.43%。

表9 紫胡萝卜复合发酵饮料中挥发性风味物质的种类和含量Table 9 Content and kinds of volatile compounds of purple carrot compound fermented beverage

酮类化合物主要有香叶基丙酮、（Z）-五癸-6-烯-2-酮、β-紫罗兰酮等，香叶基丙酮是71 种挥发性物质中含量最高的。酮类通常是不饱和脂肪酸氧化而成[36]，其中香叶基丙酮具有甜木兰花香[37]，β-紫罗兰酮具有紫罗兰花香[38]。

醛类化合物主要有反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、苯甲醛等，醛类物质通常阈值较低，较低浓度时对气味也能起到积极促进作用[39]，通常由多酚氧化或醇类转化而来[40]。反式-2-癸烯醛、反式-2-辛烯醛都具有脂香和清香[41]，壬醛具有柑橘、玫瑰清香[42]，苯甲醛具有果味和杏仁味[43]。

醇类化合物有里哪醇、壬醇、辛醇、柏木醇等。醇类在发酵过程中有糖代谢合成和芳香族氨基酸降解合成两条途径[44]。里哪醇不仅是呈香物质，也是健康活性成分，具有清香和果香，壬醇具有强烈的玫瑰和橙子香气，辛醇具有油脂和柑橘香味，柏木醇具有温和的柏木芳香[45]，会使发酵饮料风味更加复合浓郁。

酯类化合物主要有δ-十二内酯、邻苯二甲酸二异丁酯、异硫氰酸烯丙酯等，酯类物质通常呈现多种水果香味，发酵过程可以促进酯类的形成[46]。δ-十二内酯具有桃子果香[47]，邻苯二甲酸二异丁酯具有芳香气味[48]，异硫氰酸烯丙酯是含介子苷类十字花科蔬菜及其加工产品中的独特风味物质，具有一定的辛辣味和芳香味[36]。

酸类化合物包括乙酸、癸酸和壬酸。酸类主要在发酵过程中形成[49]。乙酸含量13.14%，在检测出的挥发性物质中含量排第二位。有机酸不仅能产生酸味，还能提供其他香气物质的前体，共同构成了发酵饮料的酸甜口感。

其他化合物包括苄腈、新植二烯、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、反式-2-（2-戊烯基）呋喃和甲氧基苯基-肟。腈类化合物是十字花科蔬菜特有的风味物质，带有苦杏仁味[50]，这与何洪巨等[51]的研究结果一致。这些物质虽然含量不高，但它们共同构成了发酵饮料的丰富香气。

3 结论

紫胡萝卜复合发酵饮料的最佳发酵参数为：糖添加量7%、乳酸菌接种量5‰、发酵温度41 ℃、发酵时间为38 h。该条件下得到的发酵饮料酸甜适中、色泽艳丽，总糖含量0.21 g/L，总酸含量0.38 g/L，膳食纤维含量0.41 g/L，活菌数7.42×107CFU/g，感官评分93.3 分；共检测出71 种挥发性风味物质，主要的挥发性风味物质是酮类、醛类、醇类和酸类化合物，其中，香叶基丙酮、乙酸、（E）-2-癸烯醛含量位居前三。羽衣甘蓝、冰菜和紫胡萝卜本身就具有丰富的营养价值和开发价值，本研究所得复合发酵饮料不仅气味芳香，而且酸甜适口。因此，为今后蔬菜发酵饮料的开发提供新思路，同时也增加了蔬菜加工产业的经济效益。但本研究未对发酵饮料的花青素、多酚等活性物质含量以及抗氧化性展开深入探究，后续可深入研究。