基于网络药理学研究枸杞提取液对肠道致病菌的影响

2024-01-15 04:58廖嘉宁王贞香
食品工业科技 2024年2期
关键词:正丁醇金黄色乙酸乙酯

李 倩,廖嘉宁,魏 媛,王贞香,安 琼

(河西学院医学院,甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室,甘肃张掖 734000)

枸杞,又称枸杞子、红耳坠,是茄科小灌木枸杞的成熟子实。枸杞子药食同源的历史悠久,是驰名中外的名贵中药材,因有延衰抗老的功效,故又名“却老子”。枸杞中含有多种氨基酸,并且含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等多种特殊营养成分[1],使其具有较好的保健功效。现代临床上广泛用于降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤、抗衰老、抑菌等[2]。查阅文献发现,枸杞水提取物具有一定的抑菌作用,但并未对枸杞提取液不同极性部位(石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位)的抑菌作用进行探究[3]。

目前,根据国内外统计,食物中毒出现频率较多,而细菌性食物中毒最为常见,细菌性食物中毒(bacterial food poisoning,BFP)是一种急性感染中毒性疾病,由于进食被细菌或细菌毒素所污染的食物而引起[3],为各种类型的食物中毒中最多见的一种[4]。引起食源性疾病的主要因素之一是食品中污染的病原细菌,在食物中常见的污染细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)[5]。BFP 多呈暴发起病、集体起病,发病与饮食有密切关系。临床症状以急性胃肠为主,而肉毒中毒以中枢神经系统症状(眼肌、咽肌瘫痪)为主要表现[6],一般预后良好。除了积极进行治疗外,患者也需要注意日常饮食卫生,防止再次发病[7]。

网络药理学是基于系统生物学的理论,对生物系统的网络分析,选取特定信号节点(Nodes)进行多靶点药物分子设计的新学科[8]。网络药理学强调对信号通路的多途径调节,提高药物的治疗效果,降低毒副作用,从而提高新药临床试验的成功率,节省药物的研发费用[9]。

本文通过网络药理学分析枸杞抑菌的活性成分及其作用分子机制,为枸杞的抑菌作用的研究提供理论基础。以枸杞为研究对象,对其提取物的不同极性部位进行体外抑菌作用进行研究,从而为枸杞资源开发利用提供理论依据[10]。

1 材料与方法

1.1 数据库平台

在文章中通过网络药理学分析枸杞抑菌活性成分及其作用机制,采用的数据库及网址见表1。

表1 文章中用到的数据库及网址Table 1 Databases and their URL used in the article

1.2 材料与仪器

枸杞 安徽康和中药科技有限公司;无水乙醇分析纯,利安隆博华医药化学有限公司;二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;HB 营养肉汤 青岛高科园海博生物技术有限公司;金黄色葡萄球菌ATCC6538批号:20230418 北京生物保藏中心;大肠杆菌CMCC(B)441029(批号:20230413)上海保藏生物技术中心。

HH-2 数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;SY-200 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;UV-1500PC 型紫外可见分光光度计 上海美析仪器有限公司;G154TW 立体式自动压力蒸汽灭菌器 致微仪器有限公司;QL-866 涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;SPH-103B 超凡型小容量恒温培养摇床 上海世平实验设备有限公司;LRH-150 生化培养箱 韵关市泰宏医疗器械有限公司;DZF-6090D 真空干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 枸杞活性成分筛选 在数据库TCMSP 中,以“gouqi”为关键词搜索枸杞的活性成分,筛选出口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 的活性成分[11]。在TCMSP 数据库和Swiss Target Prediction 数据库检索预测枸杞活性成分的作用靶点,然后用UniProt 数据库获得靶点信息,去除重复的靶点,获得枸杞活性成分靶点。

1.3.2 抑菌潜在靶点搜集及枸杞活性成分与疾病靶点的筛选 以“抑菌(bacteriostatic)”作为检索关键词,利用GeneCards、DisGeNET 数据库检索抑菌作用的潜在靶点。搜索Venny 2.1 软件绘制韦恩图,在列表1 中输入368 个筛选的枸杞活性成分对应的基因,在列表2 中输入2212 个疾病基因,筛选得到枸杞活性成分与抑菌的交集靶点,对获得的结果进行可视化处理[12]。

表2 枸杞的主要活性成分Table 2 Main active ingredients of goji berries

1.3.3 构建枸杞潜在靶点相互作用网络 将1.3.2 中筛选的枸杞与疾病的交集基因导入STRING 数据库中,在Protein Name 中输入基因蛋白,在Organisms中选择Homo sapiens,进行PPI 预测分析,获得的结果输入到Cytoscape 3.9.1 软件中构建枸杞潜在靶点相互作用网络[13]。

1.3.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 将上述获得的枸杞和抑菌的交集基因输入到Metascape 数据库中,选择H.sapiens 分别进行KEGG、Go 通路分析,对获得的KEGG 富集分析和前20 条信号通路绘制富集显著性统计图,对于GO 分析结果取前10 条绘制柱状图[14]。

1.3.5 构建枸杞-活性成分-抑菌靶点-通路网络 将筛选得到的枸杞活性成分,抑菌的靶点及1.6 通路富集排前10 的通路数据,导入Cytoscape 3.9.1 进行映射,构建枸杞-活性成分-抑菌靶点-通路网络。

1.3.6 枸杞不同极性部位提取液的制备 称取200 g粉碎的枸杞样品,按照料液比1:20(m/v)加入4000 mL 的80%乙醇,在沸水浴中浸提1 h,过滤,滤渣按照同样的方法浸提3 次,合并3 次滤液,趁热抽滤,滤液浓缩至原有体积的1/4,放置水浴锅加热挥发,最终得到80.1 g 浸膏[15]。称取80 g 浸膏用水溶解并定容至100 mL 容量瓶中,得到水提取物,依次用100 mL 的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次,制得石油醚萃取层、氯仿萃取层、乙酸乙酯萃取层、正丁醇萃取层,分别浓缩冻干得到石油醚萃取层0.08 g、氯仿层0.36 g、乙酸乙酯层0.28 g、正丁醇层部位5.00 g,冷藏,备用[16]。

1.3.7 菌悬液的制备 采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基活化供试菌种,用液体培养基扩大培养活化的菌种12 h,在波长600 nm 处用无菌的液体培养基调零后测定大肠杆菌的含菌培养液的吸光度为1.841,对含菌培养液进行稀释,稀释至吸光度为0.206,最后进行10 倍法稀释,将大肠杆菌稀释至1×102。同样的方法,将金黄色葡萄球菌稀释至1×103,得到菌悬液。

1.3.8 滤纸片法测定抑菌作用 将枸杞提取物不同极性部位冻干品用无菌水配制成1 mg/mL 的溶液,把直径为6 mm 灭菌滤纸片分别置入各溶液中浸泡24 h,取菌悬液0.2 mL,滴入平皿中倒有固体培养基的表面,用涂布器使其均匀涂布在培养基表面,用无菌镊子夹取已浸泡的滤纸片置入含菌平皿中,每皿4 片,并用药敏片和无菌水浸泡的滤纸片做对照[17]。在温度为37 ℃的培养箱中培养24 h 后观察抑菌情况。

1.3.9 最小抑菌浓度测定 通过1.3.8 获得对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌能力最强的极性部位,将极性部位冻干品用无菌水配制成浓度为1 mg/mL 的原液,将各原液稀释配成浓度为0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL 溶液[18]。测定相应部位样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。取0.2 mL菌悬液于培养基上涂布均匀,并用药敏片和无菌水浸泡的滤纸片做对照,将各培养皿放入37 ℃培养箱中恒温培养24 h 后观察,以培养皿中无菌生长的最低浓度作为相应部位样品对相应菌的最小抑菌浓度[19]。

2 结果与分析

2.1 枸杞活性成分筛选

运用TCSMP 在线数据库,根据OB≥30%,DL≥18%筛选得到26 个符合条件的活性成分,包括黄酮类、生物碱等,如表2 所示。

2.2 抑菌潜在靶点搜集

通过GenCards、DisGeNET 数据库筛选抑菌靶点,去除重复数值,共获得2212 个疾病靶点。在线搜索Venny 2.1 软件,输入枸杞活性成分靶点与抑菌靶点数据,取交集后得到73 个交集靶点并对结果可视化如图1 所示。

图1 枸杞与抑菌交集靶点韦恩图Fig.1 Wayne diagram of the intersection target of goji berries and bacteriostasis

2.3 枸杞活性成分靶点与抑菌靶点PPI 网络的构建

把2.2 项下获得的枸杞活性成分靶点与抑菌靶点的73 个交集靶点输入STRING 数据库进行PPI分析,生物种类设定为人类,高置信度为0.7,隐藏网络中没有关联的节点,结果如图2 所示。其中,一个靶点上的连线越多,则这一靶点蛋白等级越高。靶点之间的连线越多,可以说明靶点蛋白之间的结合度越高[20],共有69 个节点,492 条边,分析显示TNF、AKT1、EGFR 等69 个蛋白可能是枸杞抑菌作用的关键靶点。然后将获得的PPI 网络数据导入Cytoscape 3.9.1,对Degree 前20 的(如表3 所示)关键靶点的进行可视化。

图2 枸杞抑菌潜在作用靶点的PPI 网络图及核心靶点Fig.2 PPI network diagram and key targets of the potential antibacterial target of goji berry

表3 枸杞抑菌STRING 网络关键靶点Table 3 Key targets of Goji berry antibacterial STRING network

2.4 GO 功能富集分析

GO 功能富集分析如图3 所示,横坐标表生物过程(biological process,BP,橙色)、细胞组分(cell composition,黄色)、分子功能(molecular function,MF,绿色),纵坐标表示各自生物学功能所富集的靶点数。枸杞抑菌的生物学过程主要包括影响对外源性刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)、基因表达的正调控(positive regulation of gene expres-sion)、一氧化氮生物合成过程的正向调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、细胞对活性氧的反应(cellular response to reactive oxygen species)等;富集的细胞组成包括细胞壁(cell way)、质膜(plasma membrane)、胞外区(extracellular region)等。富集的分子功能(molecular function,MF)包括丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白激酶(protein kinase activity)、激酶活性(kinase activity)等。

图3 枸杞抑菌靶点的GO 分析Fig.3 GO analysis of antibacterial targets of goji berries

2.5 KEGG 通路分析

枸杞抑菌的关键靶点蛋白主要富集的通路包括癌症通路(Pathways in cancer)、化学致癌受体信号通路(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、C 型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、化学致癌与活性氧(Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF 信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细菌性痢疾(Shigellosis)、沙门氏杆菌等(Salmonella infection),如图4 所示,柱状图越长,信号通路的相关性与大。

图4 枸杞抑菌关键靶点KEGG 通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG pathway of goji berry bacteriostasis

2.6 构建枸杞-活性成分-抑菌靶点-通路网络

通过Cytoscape 3.9.1 软件构建“枸杞-活性成分-抑菌靶点-通路”网络,构建的网络有406 个节点,1296 条边。选取Degree 值及BC(betweenness centrality)值大于平均值的靶标可视化如图5 所示。其中阿托品(Atropine,Degree:101,BC:0.53)、槲皮素(Quercetin,Degree:101,BC:0.48)、亚麻酸乙酯(Ethyl linolenate,Degree:101,BC:0.44)、亚麻油酸乙酯(Mandenol,Degree:67,BC:0.16)、谷甾醇α1(Sitosterol alpha1,Degree:62,BC:0.06)、31-Norlanosterol(Degree:62,BC:0.05)、鈍叶醇(Obtusifoliol,Degree:61,BC:0.05)、花青素(Cyanin,Degree:60,BC:0.04)等度值及BC 较靠前,可能在抑菌作用中起主要贡献。

图5 枸杞-活性成分-抑菌靶点-通路网络Fig.5 Network diagram of goji berries-active components-targets-pathways

2.7 滤纸片法测定枸杞提取物不同极性部位的抑菌作用

当枸杞提取物的不同极性部位的浓度为1 mg/mL 时,石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。如图6 所示:不同极性部位对大肠杆菌的抑制作用由强到弱依次为药敏片>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>无菌水。图7 所示,不同极性部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用由强到弱依次为药敏片>正丁醇部位>石油醚部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>无菌水。

图7 不同极性部位对金黄色葡萄球菌的影响Fig.7 Effects of different polar sites on Staphylococcus aureus

2.8 最小抑菌浓度的测定

由2.7 可知乙酸乙酯部位对大肠杆菌的抑制作用最强,正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。依次将乙酸乙酯部位的浓度稀释为0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL,并用药敏片和无菌水浸泡的滤纸片做对照,得到的结果如图8 所示,乙酸乙酯部位不同浓度对大肠杆菌的抑制作用由强到弱依次为药敏片>0.75>0.50>0.25>0.125>无菌水,所以乙酸乙酯部位对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.125 mg/mL。

图8 乙酸乙酯不同浓度对大肠杆菌的影响Fig.8 Effects of different concentrations of ethyl acetate on E.coli

依次将正丁醇的浓度稀释为0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL,并用药敏片和无菌水浸泡的滤纸片做对照,得到的结果如图9 所示:正丁醇不同浓度对大肠杆菌的抑制作用由强到弱依次为药敏片>0.75>0.50>0.125>0.25>无菌水,所以正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.25 mg/mL。

图9 正丁醇不同浓度对金黄色葡萄球菌的影响Fig.9 Effects of different concentrations of n-butanol on Staphylococcus aureus

3 讨论与结论

枸杞作为药食同源的中药材,含有多糖、花色苷、黄酮、脂肪酸等多种活性成分。通过网络药理学预测分析显示,枸杞中筛选出26 个活性成分,其中阿托品、槲皮素、亚麻酸乙酯、亚麻油酸乙酯、谷甾醇α1、31-Norlanostero、鈍叶醇、花青素等在枸杞发挥抑菌起主要作用。据文献研究显示槲皮素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等多种细菌有抑制作用,其可影响细菌细胞壁和细胞膜超微结构,使其内容物渗漏[21]。谷甾醇作为甾体类化合物具有抗菌作用[22]。

枸杞中的花青素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑制作用[23]。当菌体的细胞膜受到刺激后易被破坏,使胞内离子泄露并引起代谢紊乱,菌体细胞内的一些可溶性物质会从菌体细胞中释放出来,K+是离子泄漏的典型代表,小分子电解质比核酸与蛋白质等大分子物质优先泄露[24]。黑果枸杞花青素抑菌实验的研究中显示,花青素能改变金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性,导致大量K+外泄[25]。槲皮素、谷甾醇、花青素作为枸杞发挥抑菌的主要成分预测分析的结果,与文献研究的结果一致。

枸杞活性成分靶点与抑菌靶点PPI 网络分析表明,TNF(肿瘤坏死因子)是枸杞抑菌的重要的一个靶点,TNF 是一种多功能的促炎信号因子,其可与细胞膜上特异性受体结合,参与免疫调节细胞的激活、功能和分化,具有调控防止恶性细菌感染、免疫系统、细胞凋亡等作用[26]。TNF 可通过激活T细胞免活性参与免疫应答,具有杀伤转化细胞和某些病毒感染的细胞的能力[27]。AKT1 在调节细菌的细胞过程中起核心作用,对铜绿假单胞菌感染可通过抑制AKT1/mTOR 通路诱导自噬体形成[28]。巨噬细胞作为结核分枝杆菌感染的宿主细胞,结核分枝杆菌可通过激活PI3K/Akt1/mTOR 信号通路诱导巨噬细胞的M2极化,破坏宿主的免疫反应并在巨噬细胞中存活[29]。EGFR 是一种跨膜蛋白能,其可介导细胞之间、细胞与胞外基质相互黏附,该蛋白的表达在炎症因子的启动中起着重要的作用[30]。EGFR 有时也能抑制细菌感染,比如在幽门螺杆菌感染中,缺乏EGFR 的巨噬细胞会表现出Th1 和Th17 适应性免疫反应的受损[31]。枸杞的活性成分可能参与TNF、AKT1、EGFR等这些蛋白的调控起到了抑菌作用。

Go 富集表明枸杞抑菌涉及多方面生物学过程。细胞壁位于细菌的最外层,可以维持细菌固有的形态,保护和支持细菌,并参与一些小分子物质和低分子蛋白质的运输。当细胞壁被破坏时,会引起细菌形态的改变,导致细菌成分渗漏,内外渗透失衡,最终导致细菌死亡[32-34]。一氧化氮由精氨酸通过一氧化氮合酶产生。一氧化氮能够与超氧化物等多种分子相互作用,与超氧化物形成过氧亚硝酸盐,进而介导杀菌或细胞毒性反应[35]。枸杞的活性成分槲皮素可影响细菌细胞壁和细胞膜超微结构,使其内容物渗漏;花青素可破坏了细菌的细胞膜,导致胞内离子泄露并引起代谢紊乱起从而对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等起到抑制作用。

KEGG 分析显示可抑菌过程大多与炎症反应以及癌症的发展有关。其中PI3K-Akt 信号通路,介导细胞的生长、分化、增殖等过程[36]。研究结果证明多种病原菌可通过激活PI3K/Akt 信号通路增加细菌侵袭的能力,促进细胞内在化,比如单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌K1 株、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌以及肺炎克、雷伯菌[37]。此外,与炎症有关的还有癌症信号通路、TNF 信号通路等。TNF 可通过与其受体及相关因子相互作用,从而激活核因子κB(NF-κB),调控细胞增殖、凋亡、分化,介导抗病毒、抗菌、免疫调节和细胞凋亡等生物学过程,参与各种癌症及免疫介导的疾病[38]。文章中KEGG 的分析与现有的研究结果保持一致。

在枸杞提取液的体外抑菌实验中,显示枸杞不同极性部位对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制作用,乙酸乙酯部位对大肠杆菌的抑制作用最强,正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。乙酸乙酯部位对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.125 mg/mL。正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.25 mg/mL。

综上所述,文章中通过网络药理学分析了枸杞抑菌活性成分及作用机制,结果显示枸杞发挥抑菌主要通过阿托品、槲皮素、亚麻酸乙酯、亚麻油酸酯、谷甾醇α1、31-Norlanosterol、鈍叶醇、花青素调控TNF、AKT1、EGFR 等多个靶点实现。枸杞抑菌涉及了多条信号通路,是通过多途径、多靶点进行治疗的,其中与炎症反应、癌症通路、TNF 信号通路,PI3K-Akt 信号通路介导有关;体外实验验证了枸杞不同极性部位的提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有不同程度的抑制作用,研究结果为进一步探究枸杞抑菌作用提供理论基础。

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