乳杆菌强化发酵对苦荞酵素抗氧化特性及风味的影响

边名鸿，袁天萌，杨 南，韩保林, ，黄丹丹，许 强

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000；2.川北医学院，四川南充 637000；3.南充生物医药产业技术研究院，四川南充 637000）

酵素为一种以单种或多种食材为底物，经过微生物发酵而得到的具有一定生理功能的产品[1-2]，其种类繁多，具有预防治疗心脑血管疾病、降血糖、提高免疫力的功能[3-4]，部分酵素能提高食用者体内的SOD 酶活以提高其抗氧化功能[5]。酵素原料来源较多，主要集中在植物与果蔬类，其中燕麦、青稞、苦荞等粗粮作为原料发酵酵素受到诸多学者的关注，如朱雪洋等[6]采用红曲霉发酵沙棘青稞酵素，得到一款抗氧化活性高、色泽艳丽的粗粮酵素；王霞等[7]以燕麦、青稞等为原料，通过植物乳杆菌发酵后，其DPPH 自由基清除率提高了20%。粗粮中含有大量膳食纤维，其可被乳酸菌分解为小分子活性物质，苦荞作为人们生活中常见的粗粮，其不仅含有比大米、玉米等主要粮食更多的蛋白质、维生素和微量元素，还富含其他谷类农作物没有的生物类黄酮及多种抗氧化物质[8]，是良好的酵素生产原料，但此方面的相关研究较少。

乳杆菌是酵素常用的发酵菌种，乳酸发酵可以保持或提高产品整体风味，增加抗氧化物质的含量[9]。李慧等[10]利用植物乳杆菌在内的3 种乳酸菌分别发酵枇杷浆，结果发现植物乳杆菌发酵的枇杷浆具有较好的抗氧化活性。和东芹等[11]利用植物乳酸菌对黄瓜汁进行发酵，得到在该发酵工艺下的酵素总酚含量为发酵前黄瓜汁的1.74 倍。刘倩等[12]通过比较不同菌种发酵对诺丽果酵素品质的影响，得到植物乳杆菌产SOD 酶活的能力更强，具有更高的抗氧化活性。

植物乳杆菌作为酵素发酵菌种时，可以提高酵素整体的抗氧化活性，为探究植物乳杆菌对粗粮酵素的影响，以苦荞为原料，优选强化发酵菌种并优化强化发酵工艺，探究对抗氧化特性的影响，以期获得苦荞酵素强化发酵工作菌株以及发酵工艺参数，提升苦荞酵素抗氧化能力及感官品质，为苦荞酵素产品的开发提供数据支持，同时丰富酵素发酵微生物资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦荞、蔗糖、酵素菌粉 市售；植物乳杆菌（LBS8、MRS5）、副植物乳杆菌（MC6）、副干酪乳杆菌（SL1）保藏于四川轻化工大学生物工程学院实验室；耐高温α-淀粉酶、糖化酶 均为分析纯，北京奥博星生物科技有限公司；市售酵素菌 北京川秀科技有限公司；水杨酸、没食子酸、三氯乙酸、铁氰化钾、抗坏血酸、DPPH 等 均为分析纯，合肥博美生物科技有限公司；福林酚 上海金穗生物科技有限公司。

890N-5975B 型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 科技有限公司；SPME 50/30UM DVB/CAR on PDMS 型顶空固相微萃取、手动进样柄、萃取头上海安谱科学仪器有限公司；WFZUV-2000 型紫外可见光光度计 美国安捷伦科技公司；DD-4000型离心机 四川蜀科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苦荞酵素制备工艺

图1 为苦荞酵素制备工艺流程。操作要点：打粉时需尽量打碎，以便于糖化过程顺利进行。α-淀粉酶添加量为15 U/g，液化温度控制在50 ℃左右，液化时间为30 min。糖化酶添加量为120 U/g，糖化温度控制65 ℃左右，在时间为60 min 时，煮沸升温至100 ℃，将α-淀粉酶和糖化酶灭活。通过单因素和正交试验选择最佳工艺进行接种发酵。

图1 苦荞酵素制备工艺流程Fig.1 Preparation process of tartary buckwheat Jiaosu

1.2.2 菌种培养 使用自筛乳杆菌和市售酵素菌粉混合发酵，乳杆菌、酵素菌粉分别接种于MRS 肉汤培养基进行活化，于38 ℃培养箱培养48 h 活化好的种子液体备用。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 还原力的测定 参照李世燕等[13]对毛酸浆酵素的测量方法。取经预处理后的发酵液0.2 mL，加入2.5 mL、0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液，再加入2.5 mL 质量分数10%的铁氰化钾溶液，50 ℃水浴20 min 后，流水快速冷却后加入2.5 mL 质量分数为20%的三氯乙酸，离心机3600 r/min 离心15 min，取上清液2.5 mL 加去离子水2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%三氯化铁，以去离子水作参比在700 nm 下测吸光度。

1.2.3.2 总酚的测定 参考李杰等[14]使用福林酚比色法测定核桃青皮果蔬酵素中总酚含量的方法。在25 mL 比色管中加入稀释十倍的经预处理的样液1 mL，加2.5 mL10%福林酚混匀，静置3 min 后加入1 mL12%碳酸钠，混匀后定容至25 mL，45 ℃水浴避光显色30 min，取出后迅速冷却，696 nm 处测吸光度。

1.2.3.3 总黄酮的测定 参照拐枣中总黄酮的测定方法[15]。取芦丁标准品，用60%乙醇配制0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，取七支25 mL 比色管，分别加入0、2、3、4、5、6、7 mL 芦丁标准溶液，分别加入1 mL 5%亚硝酸钠混匀后静置6 min，分别加入1 mL 10%硝酸铝混匀静置6 min，分别加入10 mL 4%氢氧化钠后用60%乙醇定容至25 mL，混匀静置15 min，在510 nm 处测吸光度。

1.2.3.4 SOD 酶活力的测定 参照国标GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》。

1.2.3.5 谷胱甘肽的测定 参考谷胱甘肽的酶法合成条件优化中谷胱甘肽含量测定方法[16]。取TDNB和磷酸二氢钠制成0.01 mol/L 的DTNB 溶液，棕色瓶低温保存，取三羟甲基氨基甲烷配制成0.25 mol/L Tris-HCl 溶 液，将0.25mol/L Tris-HCl 溶液以及0.01 mol/L 的DTNB 溶液99：1 体积比混合后得0.1 mmol/L DTNB 分析液，现配现用。用谷胱甘肽标准品配制1 g/L 的谷胱甘肽溶液，分别配制成0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L 的谷胱甘肽溶液。取七只试管，分别加入上述谷胱甘肽溶液0.4 mL，加入1.2 mL 0.15 mol/L 氢氧化钠混匀，加入3%甲醛0.4 mL 混匀后静置2 min，取1 mL 加入5 mL DTNB 分析液混匀，静置5 min。在412 nm 处测定吸光度值。

1.2.4 发酵工艺单因素实验 选择发酵温度、初始糖度、料液比、酵母接种量作为苦荞酵素的发酵因素，固定发酵温度23℃、初始糖度20%、初始pH4、酵母接种量0.06%。发酵温度定为28、30 和32 ℃，初始糖度选择15°Brix、16°Brix、和17°Brix，酵母接种量设为5%、6%和7%，进行还原力、总酚、总黄酮、SOD 酶活力及谷胱甘肽的测定和感官评定。

1.2.5 正交试验设计 在单因素实验的基础上设计正交试验，以温度、糖度、料液比、接种量为变量，还原力为考查指标，对强化发酵苦荞酵素制备工艺进行优化，优化水平设计如表1 所示。

表1 发酵工艺优化正交因素水平设计Table 1 Optimization of fermentation process by orthogonal factor level design

1.2.6 风味成分分析

1.2.6.1 GC 条件 柱温50 ℃维持3 min，以5 ℃/min升温至270 ℃，运行时间60 min；汽化室温度250 ℃，载气为高纯度氦气（99.999%），载气流量1.0 mL/min；不分流进样，溶剂延迟时间1 min。

1.2.6.2 MS 条件 离子源为EI 源，接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子能量70 eV，倍增器电压1396 V，溶剂延迟时间2 min，质量扫描范围29～500。

1.2.6.3 挥发性成分定性方法 采用GC-MS Postmm Analysis 软件完成，未知化合物采用Wiley 和NIST 谱库检索，根据所得谱图进行匹配分析。与数据库对比，匹配度＞85%的鉴定结果才予以确认。

1.2.6.4 定量方法 采用面积归一法，将色谱图中的共有峰面积值相加作为峰总面积，每个峰面积与总面积之比即为该物质的相对含量。

1.2.7 苦荞酵素感官品评 由7 名有经验的酵素品评员组成评定小组，参考QB/T 5323-2018《植物酵素》感官品评标准，对苦荞酵素色泽、组织形态、滋味、气味、杂质5 个指标进行单因素的感官评定，要求品评员必须客观进行评价，品评的时间间隔为5 min。总分100 分，具体评定标准如表2，所有指标加权得分即为感官评分。

表2 酵素感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria for Jiaosu

1.3 数据处理

数据以平均值±标准差表示，使用SPSS 19.0 进行数据分析，P＜0.05 表示不同菌种发酵差异显著，Origin 2021 进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同乳杆菌对苦荞酵素活性物质、SOD 酶活力、还原力的影响

SOD 是常用的氧自由基专一清除剂，SOD 活性多用作于评判保健食品的保健功能[5]，由表3 可知，加入了乳杆菌酵素的SOD 酶活与还原力均高于未添加乳杆菌组，其中SL1 的SOD 酶活最高（230.55 U/mL）且显著高于其他试验组（P＜0.05），这可能是由于酵素制作中，不同菌种混合发酵对酵素还原力及SOD 酶活都有较大影响[17-18]，其中SL1 发酵苦荞酵素与丁玉峰等[19]使用乳酸菌发酵葡萄酵素相比，苦荞酵素的SOD 酶活力为葡萄酵素的7 倍，LBS8 的总还原力与黄酮含量最高，分别为0.741 mg/mL（以VC计）与0.18 mg/mL，显著高于其他试验组（P＜0.05）；酵素的颜色、口感和风味受酵素中酚类物质含量影响[17]，MRS5 的总酚含量为2.73 mg/mL 与LBS8 无明显差异，且两者均显著高于其他试验组（P＜0.05）；加入乳杆菌的谷胱甘肽含量均低于未添加的；还原力是黄酮、酚类物质以及乳杆菌等产生的SOD 等过氧化酶类物质清除氧自由基能力的综合指标[18]，因此确定植物乳杆菌LBS8 为强化发酵菌种。

表3 不同乳杆菌对苦荞酵素黄酮、总酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、还原力的影响Table 3 Effects of different lactobacillus on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.2 初始糖度对苦荞酵素活性物质、SOD 酶活、还原力的影响

不同的发酵糖度会影响发酵体系中pH，进而影响酵素抗氧化物质的含量[20-22]。由表4 可知，在16°Brix 苦荞酵素的SOD 酶活力为199.41 U/mL，还原力为0.476 mg/mL VC标准溶液，两者均显著高于其他试验组（P＜0.05），糖度过低会导致菌种所能利用的碳源不足，导致发酵速度缓慢，糖度过高可能会抑制微生物的生长，导致SOD 酶活力有所下降[23]；糖度为16°Brix、18°Brix 时总黄酮含量显著高于初始糖度为12°Brix 的试验组（P＜0.05）；4 组总酚含量均无明显差异；谷胱甘肽含量呈现随糖度先下降后升高的趋势，12°Brix 与18°Brix 的差异不明显且显著高于另外两个试验组（P＜0.05）；由还原力确定后续发酵初始糖度为16°Brix 进行优化试验。

表4 初始糖度对苦荞酵素黄酮、总酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、还原力的影响Table 4 Effects of initial sugar content on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reducing power of tartary buckwheat Jiaosu

2.3 料液比对苦荞酵素活性物质、SOD 酶活、还原力的影响

不同的料液配比对酵素的色泽和风味有着直接的影响[24]，由表5 可知，在料液比为1:4 时，所有指标均显著高于其他试验组（P＜0.05），但该料液比糊化时易糊锅，不便操作，综合成本考虑不选择该料液比；料液比为1:10 时，除总黄酮和SOD 酶活外，均显著低于其余试验组（P＜0.05），考虑是料液比增大使得糖浓度降低，低渗透压致使发酵受到影响，因此排除该料液比进行后续试验；料液比为1:6 与1:8 时的总黄酮与谷胱甘肽含量均无显著差异；料液比1:8 的SOD 酶活力为102.56 U/mL 显著高于另一组（P＜0.05），两组还原力无显著差异，由还原力确定苦荞酵素后续发酵料液比为1:8 进行优化试验。

表5 料液比对苦荞酵素黄酮、总酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、还原力的影响Table 5 Effects of material liquid ratio on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.4 接种量对苦荞酵素活性物质、SOD 酶活、还原力的影响

在料液比为1:8，糖度16°Brix 时，由表6 可知，整体还原性物质都呈现先升高后下降的趋势，是因为接种量低时，发酵时间过长，容易导致杂菌污染，而接种量高时会使得发酵过快，营养物质消耗过快，发酵产物转化率降低[25]，在接种量为6%时总黄酮为0.36 mg/mL，总酚为2.59 mg/mL，谷胱甘肽为0.26 mg/mL，且均显著高于其余试验组（P＜0.05），因此确定苦荞酵素后续试验接种量为6%进行优化试验。

表6 接种量对苦荞酵素黄酮、总酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、还原力的影响Table 6 Effects of inoculation amount on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.5 发酵温度对苦荞酵素活性物质、SOD 酶活、还原力的影响

由表7，苦荞酵素在30 ℃时总黄酮为0.52 mg/mL，均显著高于其他试验组（P＜0.05），与全琦等[26]研究结论相符，温度过高和过低都会对微生物代谢造成影响，导致产品品质降低，适宜的温度有助于黄酮等活性物质的释放。SOD 酶活力呈现先升后降的趋势，在30 ℃时最高为253.89 U/mL 显著高于其他对照组（P＜0.05），分析原因可能是过高的温度不适宜微生物代谢导致SOD 酶活降低，还原力在30 ℃达到最高为0.503 mg/mL VC标准溶液，与35 ℃无显著差异，且两者显著高于其他试验组（P＜0.05），与刘秀娟等[27]混菌发酵苹果酵素的发酵温度相近；在35 ℃的总酚含量为3.23 mg/mL 显著高于其他试验组（P＜0.05），在30 ℃的谷胱甘肽为0.28 mg/mL 与35 ℃无显著差异；综合主要指标还原力与SOD 酶活力确定30 ℃为后续发酵温度进行优化试验。

表7 发酵温度对苦荞酵素黄酮、总酚、谷胱甘肽、SOD 酶活、还原力的影响Table 7 Effects of fermentation temperature on flavonoids,total phenols,glutathione,SOD enzyme activity,and reductivity of tartary buckwheat Jiaosu

2.6 工艺正交试验优化

通过正交试验分析温度、糖度、料液比、接种量对苦荞酵素还原力和SOD 酶活力的影响，由表8 中极差值分析可知，影响苦荞酵素还原力的因素主次顺序为C＞B＞D＞A，苦荞酵素中还原力越大越好，其最优工艺是A3B2C1D2，即发酵温度为32 ℃，糖度16°Brix，料液比1:7，接种量6%，所得酵素中还原力为0.753 mg/mL VC标准溶液。SOD 酶活力为272.12 U/mL，总黄酮含量为0.521 mg/mL，总酚含量为2.75 mg/mL，谷胱甘肽含量为0.273 mg/mL。

表8 苦荞酵素工艺优化正交试验结果Table 8 Orthogonal test results for optimizing the fermentation process of tartary buckwheat Jiaosu

2.7 风味物质分析结果

由图2 和表9 可知，苦荞酵素中的风味成分主要以醇类和酯类为主，含有少量的酮类、酸类以及其他物质。其中酯类物质以乙酸乙酯为代表，相对含量为5.34%，乙酸乙酯可以为苦荞酵素提供果香味，是由酵母氨基酸或糖代谢产生的高级醇和乙酰辅酶A 反应形成[28]。其次为亚油酸乙酯，相对含量为4.88%，其有降低血液中胆固醇和血脂的作用，十一酸乙酯具有椰子香气，可以赋予苦荞酵素特殊风味。醇类物质含量最高，总相对含量为37.09%，酵素中的醇类化合物主要通过酵母菌等微生物利用糖、蛋白质及氨基酸等物质代谢产生[29]，苦荞酵素中醇类主要是通过有氧条件下的脱羧反应产生，能增加苦荞酵素的醇厚感[30]。较郭红莲等[31]天然枸杞酵素发酵中醇类物质共检测出11 种，苦荞酵素共检测出20 种，风味物质种类更加丰富。其中甲醇含量较高的原因可能是苦荞壳中的果胶含量较高，后续工艺优化可在苦荞壳去除率上进一步研究。孙芸娅[32]在苦荞酒甲醇来源研究中发现，苦荞糖化过程中采用黑曲糖化较黄曲，成品酒的甲醇含量增加了5 倍，因此也可在糖化过程中探究加入不同糖化曲以降低苦荞酵素中甲醇含量。同时酵素在存放过程中甲醇含量也会下降，因此可对其存放过程中的甲醇含量变化进行研究。酮类物质主要是经过不饱和脂肪酸或氨基酸氧化、降解或是在发酵过程中代谢产生，丁二酮可以为酵素提供特殊的奶油风味。其他类物质中存在着甲苯检出的情况，而甲苯一般是由外源添加剂或生产过程中接触到塑料材质等所引起，因此在后续制作中应严格控制生产安全。D-天门冬氨酸含量为0.43%，高熳熳等[33]在糙米酵素中也同样检测出0.543 mg/mL 的天门冬氨酸，其不仅可以起到鲜味作用，还可以在一定程度上缓解人体疲劳。

表9 苦荞酵素中挥发性香气物质检测结果Table 9 Detection results of volatile aroma substances in tartary buckwheat Jiaosu

图2 最佳发酵工艺组合的GC-MS 总离子流图Fig.2 GC-MS Total ion flow diagram of optimum fermentation technology combination

2.8 强化发酵酵素与自然发酵酵素、商品酵素对比分析

由表10 可知，自然发酵与市售酵素菌粉发酵所测总黄酮含量、总多酚含量、谷胱甘肽含量、还原力与SOD 酶活力均低于添加LBS8 植物乳杆菌的强化发酵组，说明苦荞在经LBS8 强化发酵后能提高其抗氧化能力。

表10 强化发酵与自然发酵、商品酵素发酵对比分析Table 10 Comparative analysis of enhanced fermentation,natural fermentation,and commercial Jiaosu fermentation

3 结论

经工艺优化后，LBS8 植物乳杆菌强化发酵苦荞酵素的总黄酮含量、谷胱甘肽含量均显著高于工艺优化前（P＜0.05），通过植物乳杆菌强化发酵以后的苦荞酵素，其还原力显著高于市售酵母粉发酵的苦荞酵素（P＜0.05），说明植物乳杆菌发酵苦荞有助于苦荞酵素抗氧化能力的增强。LBS8 作为本试验4 种乳杆菌中综合情况最佳的菌株，通过发酵工艺优化后，其发酵所得苦荞酵素中，挥发性香气物质丰富，较枸杞酵素所检测出的醇类物质种类更多，说明苦荞在风味上也具有更进一步的研究价值。

通过乳杆菌强化发酵苦荞酵素，较市售酵素菌粉发酵，其抗氧化能力提高了30.73%，除了在抗氧化能力上进行探究外，对苦荞酵素的其他特征物质还可以进一步改进。本试验为苦荞酵素发酵提供了一定的数据支撑，同时也为粗粮酵素开发与利用提供理论依据，后续可以通过将乳杆菌运用到更多的粗粮酵素发酵中，更进一步完善粗粮酵素发酵菌种的选择以及关键工艺的优化。