盐胁迫下欧李叶片叶绿体结构及功能与超微弱发光激发的关系

孙 聪,朱 成,李东方,张 洁,郭金丽

(内蒙古农业大学 园艺与植保学院,呼和浩特 010010)

超微弱发光(ultraweak luminescence,UWL)普遍存在于生命体中,是一种自然发光现象,因其辐射强度极低[1～103hv/(s·cm2)]而得名[1]。UWL与生物体生理反应以及生化过程有着紧密联系[2],是植物生命过程的一个极其灵敏的指示器[3],有望成为破译植物生命活动真实信息和揭示生理代谢客观规律的新途径。但是,有关UWL 与植物生长发育关系的研究刚刚起步,尚无法将UWL 现象与植物的某一特定生理过程或化学反应联系起来,有待于更多的试验研究验证,以便于UWL 更好地为农业服务。

叶绿体是一种独特的植物细胞器,作为高效且自给自足的代谢工厂,它们可通过叶绿素和光系统进行光合作用,并将光能转换为可供植物利用的化学能[4]。叶绿素作为叶绿体光合作用中的聚光色素和反应中心色素,承担着光能的吸收和传递作用,开启了光合作用的第一步[5]。

反应中心色素分子通过光化学反应将光能转变为电能后,产生的电子通过一系列电子传递体的传递,同时偶联光合磷酸化形成ATP,将电能转化为活跃的化学能[6]。光系统(photosystem,PS)是进行以上电子传递与光合磷酸化偶联将电能转化为活跃化学能的光合机构[7-8]。叶绿素、PS均定位于叶绿体类囊体膜上,是叶绿体进行光合作用和能量转换的主要光合色素和光合机构,叶绿素代谢情况和PS活性决定了叶绿体功能及其进行光合作用和能量转换的效率[9-11]。

从叶绿体承担的作用与功能来看,它应与植物中UWL的产生来源有关,或起关键作用。那么,叶绿体是否与植物中UWL产生来源有关? 叶绿体功能的发挥与UWL有何联系? 这些问题的研究鲜见报道。

欧李(Cerasushumilis)属蔷薇科樱桃属矮生灌木,具有耐盐碱的特点[12],是进行盐调控试验的理想材料。但有关欧李与UWL的关系及其产生来源鲜见报道。本试验针对以上问题,以欧李为材料,以叶绿体及其功能应与UWL来源有关作为主要切入点,通过研究叶绿素代谢、PSⅡ活性、光合性能及能量水平等叶绿体功能与UWL 的关系,揭示叶绿体及其功能与UWL激发的联系,以期为研究UWL与植物的关系及机制提供理论基础和新思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采用内蒙古农业大学欧李科研基地的2 年生‘蒙原’欧李盆栽苗为试验材料。

1.2 试验方法

选择长势基本一致、无病虫害的欧李盆栽苗于温室内进行试验。根据预实验结果,NaCl胁迫处理设定400,800 mmol/L 2个浓度水平,分别记为S1、S2,每盆欧李苗一次性浇400 mL设计浓度盐溶液,以浇等量清水的盆栽苗为对照,记为CK。各处理完全随机排列,共5次重复,每重复各10盆。在试验期间进行正常浇水及田间管理。从盐胁迫第0天开始,每2 d进行1次UWL 强度及其他各项指标测定,处理时间共计12 d(取样时间以0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d表示)。取样时,选取基部往上10～20片之间的成熟叶片,用蒸馏水洗净擦干去主叶脉,按照不同方法称取质量后用液氮速冻,带回实验室进行相关指标测定。

1.3 观测指标及方法

1.3.1超微弱发光强度

使用超微弱发光测试系统(BPCL-2-SH,北京)进行测定。开机后调制高压1 100 V,预热30 min,用打孔器(10 mm)对所取欧李叶片进行打孔,迅速将打孔部分叶片平铺于测量杯中,打开光窗立即测定。每处理每次取5片叶,每片叶取样3次。以15次减去本底值最大值的平均值表示UWL强度。

1.3.2叶绿素代谢物质含量

δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、Mg-原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)含量分别参照金鑫[13]、Liu等[14]的方法进行测定。叶绿素酶(Chlase)活性采用购自睿信生物科技有限公司(泉州市)的Elisa试剂盒测定,具体方法按操作说明进行。叶绿素含量参照李合生[15]的方法测定并计算。

1.3.3光系统Ⅱ活性

利用M-PEA 连续激发式荧光仪(Hansatech,英国)测定叶绿素荧光参数Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0和ΨE0等指标,以反映PSⅡ活性。选取各处理欧李盆栽苗从基部往上第10～20片中朝向基本一致的功能叶,进行擦拭并标记,以便以后测量。测定前用仪器配备的暗适应夹对叶片进行暗适应30 min,然后进行正式测定,夹暗适应夹时应尽量避开主叶脉,每处理测定5次生物重复。

1.3.4光合性能指标

利用CIRAS-3(Hansatech,英国)便携式光合仪进行Pn、Tr、Ci和Gs等光合性能指标测定。测量时间为上午9:00-11:00,选取各处理欧李盆栽苗枝条基部往上10～20片叶中的朝向基本一致的功能叶,将叶片擦拭干净后进行测量,在测量时尽量避开主叶脉。每处理测定5次生物重复。

1.3.5核苷酸含量

ATP、ADP、AMP含量使用高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)测定。高效液相色谱仪基本配置:SPD-20A紫外检测器,SIL-20A自动进样器;液相色谱柱Wonda-Sil-C18(4.6 mm×250 mm,0.45 μm);流动相为35 mmol/L NaH2PO4缓冲液(pH 6.8),流速为0.8 mL/min,紫外检测波长为259 nm;自动进样器进样量为20 μL。核苷酸标准品(5′-ATP 钠盐、5′-ADP钠盐、5′-AMP钠盐)均购于Sigma公司[16]。试验用水为超纯水。

式中:E为能荷(EC);n为浓度;nATP为ATP浓度;nADP为ADP浓度;nAMP为AMP浓度。

1.3.6叶绿体超微结构

取植株自上向下第5～10片新鲜叶片,切成大小约为2 mm×2 mm 的组织块,用2.5%戊二醛和1%锇酸固定,乙醇逐级脱水后进行环氧树脂包埋,超薄切片机(Leica UC7)切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,在透射电镜(HT7800/HT7700)下进行观察,每个样品不同倍数取5个视野。取样时间为处理的第0天、第6天和第12天。

1.4 数据处理

采用Excel软件处理数据,Origin 软件作图,SPSS软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对欧李叶片超微弱发光强度的影响

图1显示,随着盐胁迫时间的延长,欧李叶片的UWL强度在CK中基本保持不变(图1,A),在S1处理下较缓慢下降(图1,B),在S2处理前8 d快速下降,之后基本不变(图1,C)。同时,在整个盐胁迫期间,S1和S2处理的欧李叶片UWL强度均始终明显低于CK,而S2处理又明显低于S1处理,且差异大多达到显著水平(图1,D)。以上结果说明400,800 mmol/L NaCl胁迫会导致欧李叶片UWL强度显著下降,且盐浓度越大、胁迫时间越长,UWL强度下降幅度越大。

图1 盐胁迫下欧李叶片超微弱发光强度的变化A.CK;B.S1;C.S2;CK,S1 and S2 stand for 0,400,800 mmol/L NaCl treatments,respectively;* and **i ndicate significant differences between S1 (S2) treatment and CK at the 0.05 and 0.01 levels during the same period,respectively.The same below.Fig.1 The changes of ultraweak luminescence intensities in leaves of C.humilis under salt stress

2.2 盐胁迫对欧李叶片叶绿体结构和功能的影响

2.2.1叶绿体超微结构

叶绿体是植物进行光合作用的主要场所,也是植物能量的主要来源,为明确盐胁迫对欧李叶片叶绿体功能的影响,应首先分析各处理条件下叶绿体超微结构的变化。如图2所示,CK 欧李叶片的叶绿体紧密排列在细胞壁周围,形态细长,具有典型的磷脂双层膜结构,基粒垛叠紧密,类囊体清晰可见,具有较少的淀粉粒和嗜锇颗粒;与CK 相比,S1处理增加了欧李叶片单个细胞内的淀粉粒数量,同时淀粉粒增大,基粒弥散,嗜锇颗粒增多;S2处理欧李叶片细胞叶绿体内部结构被严重破坏,叶绿体膜溶解,嗜锇颗粒和淀粉粒减少,基粒片层排列紊乱,基质片层断裂,类囊体破裂。

图2 盐胁迫下欧李叶片叶绿体超微结构的变化A,B and C mean 3 000 times,8 000 times and 15 000 times the ultrastructure of chloroplasts,respectively.O.Osmophilic granules;SG.Starch granules;GL.Grana lamellae.Fig.2 Changes of the chloroplast ultrastructure in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.2叶绿素代谢主要物质及叶绿素含量

从图3可知,随盐胁迫时间的延长,各浓度盐胁迫处理欧李叶片叶绿素合成前体物质(ALA 和Mg-ProtoⅨ)含量和光合色素(Chla、Chlb、Car、Chla+b)含量整体呈下降趋势,而叶绿素降解酶(Chlase)活性则呈升高趋势;在整个盐胁迫期间,S1和S2处理的叶绿素降解酶活性大多高于同期CK,而S2处理始终高于S1处理,其余各指标均始终低于同期CK,而S2处理低于S1处理,且盐胁迫处理与对照间大多差异显著。说明400,800 mmol/L NaCl胁迫会显著影响欧李叶片叶绿素代谢过程,从而导致其叶绿素含量显著下降,且盐浓度越大、胁迫时间越长,叶绿素含量下降幅度越大。

图3 盐胁迫下欧李叶片叶绿素代谢主要物质及叶绿素含量的变化Fig.3 Changes of chlorophyll metabolism main substances and chlorophyll contents in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.3光系统Ⅱ活性

随着盐胁迫时间的延长,各浓度盐胁迫处理欧李叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)活性主要参数Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0和ΨE0等均整体呈下降趋势(图4)。在整个盐胁迫期间,S1和S2处理叶片的PS Ⅱ活性参数均基本低于同期CK,且S2处理又明显低于S1处理,降幅大多达到显著水平。以上结果说明各浓度盐胁迫均会导致欧李叶片PS Ⅱ活性遭到明显破坏,且盐浓度越大、胁迫时间越长,PS Ⅱ损伤越严重。

图4 盐胁迫下欧李叶片光系统Ⅱ活性主要参数的变化Fig.4 Changes of the main parameters of the photosynthetic activity in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.4光合性能

随着盐胁迫时间的延长,各盐浓度盐胁迫处理欧李叶片Pn、Tr和Gs均整体呈下降趋势,而Ci则整体呈上升趋势(图5)。其中,在整个盐胁迫期间,S1和S2处理叶片的Pn、Tr和Gs均始终显著低于同期CK,且S2处理始终明显低于同期S1处理;S1和S2处理叶片Ci始终明显高于同期CK,而S2处理又明显高于同期S1,且处理间差异大多达到显著水平。以上结果说明各浓度盐胁迫均会导致欧李叶片光合性能下降,且盐浓度越大、胁迫时间越长,光合性能下降幅度越大。

图5 盐胁迫下欧李叶片光合性能的变化Fig.5 Changes of photosynthetic performance in leaves of C.humilis under salt stress

2.2.5能量水平

随着盐胁迫时间的延长,欧李叶片叶绿体能量水平在CK中基本保持不变,在不同盐浓度处理下ATP含量均呈先上升后下降趋势,ADP和AMP含量均整体呈上升趋势,能荷(EC)水平整体呈下降趋势;S1和S2处理ATP 含量在处理前期比CK 提高,后期值比CK显著降低,其叶片ADP和AMP含量始终显著高于同期CK,S2处理又始终高于同期S1处理;叶片EC水平始终显著低于同期CK,且S2处理又始终低于同期S1处理(图6)。S1和S2处理ATP 和EC降低的结果说明,盐胁迫导致欧李叶片的能量水平整体下降,且盐浓度越大、胁迫时间越长,能量水平下降幅度越大。

图6 盐胁迫下欧李叶片能量水平的变化Fig.6 Changes of energy level in leaves of C.humilis under salt stress

2.3 盐胁迫下欧李叶片叶绿体功能与UWL的关系

2.3.1叶绿素代谢主要物质及叶绿素含量与UWL强度的相关性

如表1所示,在S1处理下,除Chlase与UWL呈极显著负相关外,其余指标均与UWL 呈正相关关系,其中ALA、Mg-ProtoⅨ、Chla、Car和Chla+b与UWL的相关性为极显著,Chlb与UWL 的相关性为显著;在S2处理下,同样只有Chlase与UWL呈极显著负相关,其余指标均与UWL 为正相关关系,其中的Mg-ProtoⅨ和Car与UWL 相关性极显著,Chla、Chlb和Chla+b与UWL 呈显著正相关。以上结果表明盐胁迫下欧李叶片UWL强度与叶绿素代谢显著相关,叶绿素合成代谢加强、叶绿素含量增加时,有利于UWL 的产生,UWL 强度增加;反之,叶绿素降解代谢占优势、叶绿素含量下降时,UWL强度下降。

表1 盐胁迫下欧李叶片叶绿体功能对应指标与UWL强度的相关系数Table 1 Correlation coefficients between chloroplast function and corresponding indicators and UWL intensities in leaves of C.humilis under salt stress

2.3.2PSⅡ活性主要参数与UWL强度的相关性

在S1处理下,只有PIABS和RC/CSm与UWL呈显著正相关,其余指标基本不相关;在S2处理下,PSⅡ活性主要参数均与UWL 呈显著正相关关系,其中Fv/Fo、PIABS和RC/CSm与UWL的相关性极显著,Fv/Fm、φE0和ΨE0与UWL 的相关性显著。可见,在盐胁迫条件下,欧李叶片UWL 强度随着PSⅡ活性主要参数的下降而下降,说明UWL 与PSⅡ活性有关,PSⅡ活性较高时能够促进UWL 的激发,UWL强度增加,而PSⅡ活性下降时不利于UWL的激发,UWL强度随之下降(表1)。

2.3.3叶片光合性能与UWL强度的相关性

在S1 处理下,叶片光合参数Pn、Tr和Gs与UWL呈显著正相关,Ci与UWL呈极显著负相关;在S2处理下,Pn、Tr和Gs与UWL呈显著正相关,其中Tr相关性极显著,而Ci与UWL 呈极显著负相关。可见,在盐胁迫条件下,欧李叶片UWL强度随Pn、Tr和Gs的下降而下降,随Ci的升高而降低,说明UWL与光合作用有关,光合性能较高时能够促进UWL的激发,UWL强度增加,而光合性能下降时不利于UWL的激发,UWL强度随之下降(表1)。

2.3.4叶绿体能量水平与UWL强度的相关性

在S1处理下,叶绿体ATP 和EC 与UWL 呈极显著正相关,AMP与UWL 呈显著负相关;在S2处理下,叶绿体ADP和AMP含量与UWL 呈负相关,并分别达到显著和极显著水平,而EC 与UWL呈极显著正相关。因此,在盐胁迫条件下,欧李叶片UWL强度随ATP和EC的下降而下降,随ADP和AMP的升高而降低,说明盐胁迫下UWL与能量有关,能量处于较高水平时促进UWL 的激发,UWL强度增加,而能量水平下降时不利于UWL的激发,UWL强度随之下降(表1)。

3 讨论

叶绿体是光合作用的主要场所,也是高等植物中最活跃的细胞器,逆境胁迫极易影响叶绿体的结构和功能。在正常条件下,叶绿体结构相对稳定,多呈椭圆形,表面光滑,有的外膜上有向外突起形成的小泡,类囊体平行排列,基质片层排列规则,叶绿体结构清晰,叶绿体膜完整[17]。然而,盐胁迫会导致叶绿体膨胀破裂、结构松散、类囊体膜和片层逐渐解体、基粒片层数目减少[18-21]。本研究中盐胁迫处理也导致欧李叶片叶绿体内部结构松散,类囊体降解,基粒结构遭到破坏。盐胁迫下叶绿体结构的破坏将直接对叶绿体功能及在其内部进行的多项生理生化过程产生严重的影响。

叶绿素代谢分为叶绿素合成和降解两部分,合成与降解的动态平衡决定了叶绿素的含量[13]。ALA 和Mg-ProtoⅨ是叶绿素合成过程中的主要前体,Chlase是参与叶绿素降解的主要酶。叶绿素代谢途径的任何一步发生异常都可能会影响叶绿素的合成,导致叶绿素含量下降,进而引起光合速率降低[22]。王颖等研究发现,盐胁迫使菠菜叶片叶绿素合成受阻,进而导致叶绿素含量降低[23]。郝树芹等研究结果表明,西葫芦银叶病发病叶片和叶柄中的叶绿素合成中间产物Mg-ProtoⅨ含量下降,Chla、Chlb、Chla+b含量下降,而Chlase活性升高则进一步加剧了叶绿素的降解[24]。本试验结果显示,欧李叶片叶绿素含量随着盐胁迫时间和盐胁迫浓度的增加而下降,这主要与叶绿素合成首要前体ALA及关键合成物质Mg-ProtoⅨ含量在胁迫下的降低和Chlase活性的逐渐升高有关。

UWL作为一种在自然界中普遍存在的生物发光现象,广泛参与植物生长发育的多项进程。研究发现,UWL 的发光光谱与叶绿素的吸收光谱部分重合[25],推测植物的UWL 与叶片中叶绿素代谢有关。叶片黄色斑点和叶脉部分在UWL发光图像中呈现暗区,而叶片绿色部分则呈现亮区,这进一步揭示了叶片色素与UWL 的关系[26]。在本研究中,对欧李叶片叶绿素代谢与UWL相关性分析的结果显示,ALA 和Mg-ProtoⅨ含量与UWL 强度呈正相关关系,而Chlase均与UWL 强度呈显著负相关关系,叶绿素含量与UWL 强度呈显著正相关关系。这些结果说明,在盐胁迫条件下,欧李叶片的UWL与其叶绿素代谢有关。郭金丽等在对德景天模拟干旱处理时发现,叶片UWL 强度与其Chla、Chlb和Chl含量呈显著正相关[27]。此外,干旱胁迫下葡萄叶片UWL强度也与Chla和Chlb含量呈显著正相关[28],这与本的研究结果一致。

叶绿体通过位于类囊体的PS将光能转化为植物所能利用的化学能,所以光系统活性的变化将直接影响植物新陈代谢中能量的来源[29]。PSⅡ对逆境胁迫高度敏感,被认为是光抑制的原初位点和光损伤的主要部位[30]。盐胁迫常导致PSⅡ整体活性和性能指数的下降[31]。在本研究中,高浓度的盐胁迫导致欧李叶片PSⅡ活性参数Fv/Fm、PIABS以及RC/CSm下降,反映了盐胁迫下PSⅡ最大光化学效率和PSⅡ反应中心活性的下降。同时,本研究对PSⅡ电子供体侧和受体侧的分析中发现,盐胁迫导致Fv/Fo显著下降,表明PSⅡ电子供体侧OEC 活性降低,这与Singh 等的研究结果[32]一致。此外,本研究中ΨE0也随着盐胁迫时间延长而逐渐下降,ΨE0是对PSⅡ反应中心电子传递链性能的综合评价指标之一,同时受PSⅡ供体侧的电子供应能力和受体侧(包括PSⅠ)电子接收能力的制约[33]。在对UWL的研究中发现,PSⅡ电子传递抑制剂DCMU可部分抑制UWL 的产生[34],并且进一步的研究表明UWL可能与PS有关[35]。在本试验中,欧李叶片UWL 强度随Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0、ΨE0的降低而降低,且进一步分析也表明UWL强度与Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS、RC/CSm、φE0、ΨE0均呈正相关关系。以上结果说明在盐胁迫条件下欧李叶片UWL 的发生可能与其PSⅡ活性和电子传递的氧化还原状态密切相关。

光合作用是植物维持正常生命活动的重要环节,它是植物所需能量的直接提供者。葛江丽等认为光合作用速率的降低在盐胁迫的前期以气孔限制为主,随着胁迫程度的加重和时间的延长,非气孔因素则逐渐占据主导地位[36]。在本研究中,不同浓度的盐胁迫在诱导欧李叶片Pn、Tr和Gs下降的同时,促进了其Ci的上升,说明盐胁迫下欧李叶片光合速率的下降与非气孔因素有关,光系统活性和叶绿体结构的破坏是盐胁迫下欧李叶片光化学活性下降的主要原因。进一步对欧李叶片光合性能与UWL强度的相关性分析结果表明,UWL 强度与Pn、Tr、Gs呈正相关关系而与Ci呈负相关关系,即随着Pn、Tr、Gs的降低和Ci的升高UWL 强度降低。该结果进一步证明欧李叶片UWL的发生与其光合性能有关,这与孟亚芬等的研究结果[37]一致。

综上所述,盐胁迫下欧李叶片UWL 和叶绿素代谢及含量、PSⅡ活性、光合性能及能量水平均有关,但不同浓度盐胁迫下主要因素不同。S1处理下叶绿素代谢主要指标及叶绿素含量与UWL关系更为显著,叶绿素代谢及含量可能是轻度盐胁迫下叶绿体光合功能各过程中导致UWL强度下降的初始因子;而S2处理下,叶绿素代谢和含量以及PSⅡ活性的各指标均明显与UWL显著相关,表明重度盐胁迫下,叶绿素与PSⅡ作为叶绿体光合功能中的主要光合色素和光系统,两者协同作用,进而引起光合性能及能量水平的下降,最终导致UWL强度的下降。

4 结论

盐胁迫导致欧李叶片叶绿体超微结构遭到破坏,进而使叶绿体功能下降,具体表现为:叶绿素合成受阻、降解加速、叶绿素含量下降,PSⅡ活性下降,光合性能降低及能量水平下降。与此同时,在盐胁迫下,随着叶绿体功能下降,UWL 的激发受到抑制,UWL 强度也随之下降;进一步的相关性分析结果显示,UWL 与叶绿素代谢、PSⅡ活性、光合性能及能量水平均高度相关。以上结果说明UWL与欧李叶片叶绿体及其功能密切相关,叶绿体应是激发UWL的细胞器之一。