固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿罐装辅助食品果泥中展青霉素的含量

赵 迪,尹丹阳,袁文婷,张宇晨

(陕西省疾病预防控制中心,西安 710054)

展青霉素(patulin,PAT)又称棒曲霉素,是一种有毒的真菌次级代谢产物[1]。20世纪40年代展青霉素作为抗生素被发现,主要存在于霉变水果及其制品中。人类膳食中展青霉素的最主要来源是苹果及其制品[2]。展青霉素是一种极性不饱和内酯类小分子化合物,属于聚酮类代谢产物,在酸性条件下稳定。在动物研究中,展青霉素可对人体不同器官造成损害,包括脑、肾、肝和胸腺[3-6]。毒理学试验证明其具有毒性、诱变性、致癌性和致畸性[7],国际癌症研究中心将其归为第三类物质[8]。

婴幼儿罐装辅助食品果泥主要原料是苹果汁、梨汁和山楂等,展青霉素污染也是该类产品中值得关注的问题。由于婴幼儿对毒素污染物的敏感性,欧盟委员会法规(EC)No 1881/2006针对婴幼儿辅食规定婴幼儿食用的苹果汁和固体苹果产品及婴幼儿食品(除婴幼儿食用的谷物加工食品)中展青霉素的限量值为10 μg•kg－1。文献[9]对2006－2009年陕西产苹果浓缩汁中展青霉素的污染水平进行调查,发现2007年陕西产苹果浓缩汁有少量样品中展青霉素超50μg•kg－1。陕西省市售的婴幼儿罐装辅助食品(果泥)可能也存在类似的风险,因此对其展青霉素的污染情况进行监测十分必要。

展青霉素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[10]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[11]和超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)[12]等。目前关于水果源制品中展青霉素检测方法较多,而针对婴幼儿罐装辅助食品果泥中展青霉素的检测报道比较少。果泥样品含有蛋白质、脂肪和碳水化合物等多种物质,基质复杂。不同果泥样品在液相色谱-质谱上的基质效应也存在差异,影响定量准确度。因此,本工作采用乙酸乙酯提取,MAX 固相萃取柱净化,采用同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法测定陕西省市售的以苹果、山楂和梨为主要原料的33份婴幼儿罐装辅助食品果泥中展青霉素的含量,以了解陕西省市售的婴幼儿罐装辅助食品果泥中展青霉素的污染情况。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex U3000 型超高效液相色谱仪;5500Qtrap型三重四极杆串联质谱仪,配电喷雾离子源和流动注射泵;Milli-Q 型超纯水制备系统;Waters Oasis MAX 固相萃取柱(150 mg/6 mL);MycoSep 228多功能净化柱。

展青霉素标准溶液:100.1 mg•L－1。

13C7-展青霉素同位素内标溶液:25.13 mg•L－1。

展青霉素标准储备溶液:1.00 mg•L－1,取100.1 mg•L－1展青霉素标准溶液0.10 mL,用4%(体积分数,下同)乙酸溶液定容至10 mL,配制成1.00 mg•L－1的展青霉素标准储备溶液,于4 ℃避光保存。

13C7-展青霉素同位素内标工作溶液:取25.13 mg•L－113C7-展青霉素同位素内标溶液0.40 mL,用4%乙酸溶液定容至10 mL,配制成1.01 mg•L－1的13C7-展青霉素同位素内标工作溶液,于4 ℃避光保存。

展青霉素标准溶液系列:取适量的展青霉素标准储备溶液和13C7-展青霉素同位素内标工作溶液,用0.2%(体积分数,下同)乙酸溶液配制成质量浓度为10.0,20.0,50.0,80.0,100,150,200μg•L－1的展青霉素标准溶液系列,其中同位素内标质量浓度为50.5μg•L－1。

果胶酶溶液(≥5 units/mg protein);乙酸乙酯、乙酸铵、乙酸均为色谱级;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温40 ℃;流量0.3 mL•min－1;进样体积10μL;流动相A 为水,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～3.0 min时,B 为5%;3.0～3.1 min时,B 由5%跳转至95%,保持0.9 min;4.0～4.1 min时,B由95%跳转至5%,保持2.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,负离子(ESI－)模式;多反应监测(MRM)扫描方式;电喷雾电压－4 500 V;气帘气压力206.8 kPa;雾化气压力275.8 kPa;辅助气压力275.8 kPa;离子源温度550 ℃;碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)见表1,其中“∗”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取1 g样品(精确至0.001 g)于50 mL 离心管中,加入50μL13C7-展青霉素同位素内标工作溶液,静置片刻后,再加入20 mL水与200μL果胶酶溶液,混匀,于55 ℃酶解2 h 后取出,以转速5 000 r•min－1离心5 min。收集上清液于50 mL离心管中,加入乙酸乙酯10 mL,盖紧盖子,涡旋混合10 min,以转速5 000 r•min－1离心5 min,吸取上层乙酸乙酯相,转移到另一50 mL离心管中。重复提取一次,合并乙酸乙酯相,于40℃氮吹至近干,加入4%乙酸溶液5 mL 溶解残渣,待净化。MAX固相萃取柱预先用3 mL 甲醇、3 mL 水活化,将上述溶液全部过柱,自然滴下。上样完毕后,依次加入3 mL的5 mmol•L－1乙酸铵溶液、3 mL 水淋洗。抽干MAX 固相萃取柱,用4 mL 甲醇洗脱,收集洗脱液。在洗脱液中加入20μL乙酸,于40℃氮气缓缓吹至近干,用0.2%乙酸溶液定容至1.0 mL,涡旋30 s溶解残留物,经0.22μm 滤膜过滤,按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

MRM 模式下标准溶液的色谱图见图1。

图1 标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of standard solution

2.2 色谱柱的选择

展青霉素为强极性化合物,同时相对分子质量较低,因此试验比较了Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和Waters BEH Hilic(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等两种色谱柱对目标物的分离效果。结果发现,采用Waters BEH C18色谱柱时,展青霉素的出峰时间相对较晚,能较好地与杂质分离,峰形较好,质谱响应值高。因此,试验选择Waters BEH C18色谱柱作为展青霉素的分离柱。

2.3 质谱条件的选择

展青霉素具有较强的电负性,因此试验选择ESI－模式。采用针泵模式进样,对质量浓度为100μg•L－1的展青霉素和13C7-展青霉素标准溶液进行一级质谱扫描,确定母离子分别为m/z153.0和160.0。然后对母离子进行二级质谱扫描,展青霉素选择丰度次高,背景干扰较小的m/z81.0为定量离子,m/z109.0为定性离子,13C7-展青霉素选择丰度高,背景干扰较小的m/z115.0 为定量离子,m/z86.0 为定性离子。具体的质谱条件见1.2.2节。

2.4 固相萃取柱的选择

果泥样品基质复杂,需要去除提取液中各种杂质的干扰。试验比较了Waters Oasis MAX 固相萃取柱和MycoSep 228 多功能净化柱的净化效果。Waters Oasis MAX 固相萃取柱是反相和强阴离子交换复合模式聚合物吸附柱;MycoSep 228多功能净化柱是以极性、非极性及离子交换等基团组成填充剂,可选择性吸附样液中的脂类、蛋白质类等杂质。展青霉素基质加标溶液经酶解,乙酸乙酯提取后,分别经过Waters Oasis MAX 固相萃取柱和MycoSep 228多功能净化柱净化。结果显示,展青霉素在两种固相萃取柱上的加标回收率均达到95.0%以上,而Waters Oasis MAX 固相萃取柱价格相对便宜,且操作流程简便,因此试验选择Waters Oasis MAX 固相萃取柱进行净化。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

试验采用同位素内标法定量降低和消除基质效应对展青霉素测定结果的影响。按照仪器工作条件测定展青霉素标准溶液系列,以展青霉素的质量浓度为横坐标,展青霉素和同位素内标峰面积比值为纵坐标,绘制标准曲线。结果显示,展青霉素标准曲线的线性范围为10.0～200μg•L－1,所得线性回归方程为y＝5.600×10－3x－4.360×10－4,相关系数为0.999 7。

以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果显示,展青霉素的检出限为2μg•kg－1,测定下限为6μg•kg－1。

2.6 精密度和回收试验

对阴性果泥样品进行10 μg•kg－1(低)、20μg•kg－1(中)和50μg•kg－1(高)等3 个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知,果泥中展青霉素的回收率为101%～112%,测定值的RSD 为2.2%～3.5%,说明方法具有较高的准确度和精密度。

2.7 样品分析

从陕西省10个地市的商店和网店共采集33份婴幼儿罐装辅助食品果泥样品,按本工作建立的超高效液相色谱-串联质谱法进行检测,均未检出展青霉素,表明目前市面上的婴幼儿罐装辅助食品果泥质量状况良好。MRM 模式下实际样品及加标样品的色谱图如图2所示。

本工作通过优化色谱柱和样品前处理条件,提出了超高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿罐装辅助食品果泥中展青霉素含量的方法,同位素内标定量,消除和降低了基质效应对检测结果的影响。该方法简单、准确、灵敏,能满足欧盟对婴幼儿及儿童食品(非加工谷物制品)中展青霉素残留的检测要求。