敲低lncRNA MIR31HG 对肝细胞癌细胞黏附、侵袭、迁移和上皮间质转化的影响及其机制

耿蕴峰，张景承，薛菲，王冬冬

石家庄市人民医院普外二科，石家庄 050030

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的一种类型，占85%～90%，也是全球癌症相关死亡的第三大原因。尽管在过去几十年里HCC 的治疗取得了很大进展，但手术切除仍然是其首选的治疗方法。由于术后易复发和转移，HCC 的总体预后仍不能令人满意［1］。目前，HCC 发生、发展的确切分子机制尚不完全清楚。因此，阐明HCC 发生、发展的分子机制，对研发特异性靶向治疗药物具有重要意义。MIR31HG 是一种长度为2 166 bp 的长链非编码RNA（lncRNA），定位于人染色体9p21.3。研究表明，作为一种新的肿瘤调节因子，MIR31HG 可通过多种机制调控肿瘤的发生、发展以及治疗耐药，并与患者预后有关［2］。但MIR31HG 在HCC 中的研究甚少，其具体作用机制尚不明确。有研究报道，lncRNA 可作为一种竞争性内源RNA（ceRNA），与miRNA 竞争性结合以减少miRNA 对其靶基因的调控，从而参与肿瘤的发生、发展［3］。miR-361 是目前研究较多的肿瘤相关微小RNA。研究证实，在HCC中miR-361 可作为抑癌基因抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，并且还能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［4-6］。有研究发现，MIR31HG 可作为ceRNA 竞争性结合miR-361的3'UTR，从而干扰miR-361对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响［7-9］。但MIR31HG 能否作为ceRNA 干扰miR-361，从而影响HCC 细胞的黏附、迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）目前尚不清楚。2022 年4 月—2023 年4 月，本研究探讨了敲低lncRNA MIR31HG 对HCC 细胞黏附、侵袭、迁移和EMT的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常肝细胞系LO2、高侵袭性HCC细胞系MHCC97H 和低侵袭性HCC 细胞系MHCC97L，购自美国ATCC。MIR31HG特异性siRNA（MIR31HG siRNA）及阴性对照siRNA（NC siRNA）、MIR31HG野生型（WT）及突变型（MUT）双荧光素酶报告基因质粒、miR-361 模拟物（miR-361 mimics）及阴性对照模拟物（NC mimics），购自上海吉玛制药技术有限公司。所有引物序列购自美国Promega 公司。Transwell 小室，购自美国Millipore 公司；PCR 仪，购自瑞士Roche公司；酶标仪，购自美国Bio-TeK 公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、Green®PrimeScriptTMRT-PCR Kit，购自日本TaKaRa 公司；CCK-8，购自武汉博士德生物工程有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自美国Promega 公司。上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、纤连蛋白（Fibronectin）、GAPDH 一抗及HRP 标记的IgG 二抗，购自美国Abcam公司。

1.2 细胞传代培养 将LO2、MHCC97H、MHCC97L细胞接种于含10% FBS 的RPMI 1640 培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。待细胞生长至70%～80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化、计数，按1∶3传代。取传3代、对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 细胞筛选 取传3 代、对数生长期细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度和浓度合格。按PrimeScript™RT Master Mix 说明，将总RNA 逆转录合成为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，按Green®PrimeScriptTMRT-PCR Kit说明进行PCR 扩增。引物序列：MIR31HG 上游引物5'-AGTTTGTGGCCCAGTTTCCA-3'、下游引物5'-CACCGCTCAGTAGTCGATCC-3'，内参GAPDH 上游引物5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'、下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；miR-361 上游引物5'-TTGCATAGTCACAAAAGTGAT-3'、下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，内参U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反应体系共25 µL：2 × One Step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 µL，cDNA 模板2 µL，上下游引物各1 µL，ddH2O 8.5 µL。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 45 s、72 ℃30 s 共40 个循环。PCR 扩增反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以GAPDH 或U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。选择lncRNA MIR31HG相对表达量较高的HCC细胞进行后续实验。

1.4 分组转染 取传3 代、对数生长期HCC 细胞，接种于6 孔板，每孔1 × 104个，随机分为对照组和敲低组，每组设6 个复孔。然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h，按Lipofectamine2000说明，采用脂质体转染法，对照组转染NC siRNA、敲低组转染MIR31HG siRNA。转染6 h 更换新鲜培养基，继续培养48 h，采用RT-qPCR 法验证转染效率。具体步骤参照1.3。

1.5 细胞黏附能力检测 采用细胞-基质黏附实验。Matrigel 基质胶包被96 孔板，37 ℃风干过夜。次日，每孔加入含2%牛血清白蛋白的细胞培养液，37 ℃封闭1 h。收集两组转染48 h 细胞，用含0.1%牛血清白蛋白的培养液重悬制成单细胞悬液，细胞密度为5 × 105/mL。取细胞悬液100 µL 接种于96孔板中，37 ℃孵育2 h，PBS 清洗去除96 孔板中未黏附的细胞，每孔加入CCK-8 溶液10 µL，继续孵育4 h。酶标仪于450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD450值代表细胞黏附能力。

1.6 细胞侵袭和迁移能力检测 采用Transwell 小室实验。①细胞侵袭能力检测：用Matrigel 基质胶包被Transwell 小室上室面。收集两组转染48 h 细胞，制成密度为1 × 105/mL 单细胞悬液。取细胞悬液200 µL 加入Transwell 小室上室，下室加入含10%FBS 的RPMI 1640 培养基500 µL。然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去上室面未穿膜细胞，5% 戊二醛溶液固定30 min，0.1%结晶紫染色，倒置显微镜下拍照观察。随机选取5个200倍视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。②细胞迁移能力检测：Transwell小室上室面不包被Matrigel基质胶，其余步骤同细胞侵袭能力检测。

1.7 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。收集两组转染48 h细胞，加入RIPA 裂解液冰上充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。加入5 × 上样缓冲液，100 ℃水浴变性。取变性蛋白40 µg，SDS-PAGE分离。电泳结束，采用半干转移法将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。5%脱脂牛奶室温封闭，分别滴加E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin、GAPDH 一抗（稀释比均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，TBS 洗膜后，滴加HRP标记的IgG二抗（稀释比为1∶5 000），37 ℃孵育1 h。ECL 发光，暗室内曝光、显影。凝胶成像仪采集图像，Gel-Pro Analyzer 凝胶图像处理软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8 MIR31HG 与miR-361 的结合位点预测与验证 通过LncBase V. 2 在线软件预测lncRNA MIR31HG与miR-361的结合位点。

取传3代、对数生长期HCC细胞，接种于24孔板，每孔1 × 104个，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，按照Lipofectamine2000说明，采用脂质体转染法，将MIR31HG WT、MIR31HG MUT 与miR-361 mimics、NC mimics 共转染HCC 细胞。转染24 h，收集细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料经Kolmogorov-Smirnov 检验符合正态分布，以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞筛选结果 MHCC97H、MHCC97L、LO2细胞lncRNA MIR31HG 相对表达量分别为2.69 ±0.22、1.94 ± 0.17、1.02 ± 0.04，miR-361 相对表达量分别为0.29 ± 0.07、0.61 ± 0.11、0.98 ± 0.03。MHCC97H、MHCC97L 细胞lncRNA MIR31HG 相对表达量均高于LO2 细胞（t分别为12.94、9.12，P均＜0.05），miR-361 相对表达量均低于L02 细胞（t分别为15.69、5.62，P均＜0.05）；MHCC97H 细胞lncRNA MIR31HG 相对表达量高于MHCC97L 细胞（t=4.67，P＜0.05），miR-361 相对表达量低于MHCC97L 细胞（t=4.25，P＜0.05）。因此，选择MHCC97H细胞进行后续实验。

2.2 lncRNA MIR31HG 敲低效率验证结果 敲低组与对照组lncRNA MIR31HG 相对表达量分别为0.20 ± 0.06、1.05 ± 0.02，敲低组lncRNA MIR31HG相对表达量低于对照组（t=23.28，P＜0.05）。

2.3 敲低lncRNA MIR31HG 对HCC 细胞黏附能力的影响 敲低组与对照组细胞黏附能力分别为0.14 ± 0.02、0.36 ± 0.04，敲低组细胞黏附能力低于对照组（t=8.52，P＜0.05）。

2.4 敲低lncRNA MIR31HG 对HCC 细胞侵袭和迁移能力的影响 在Transwell 侵袭实验中，敲低组与对照组穿膜细胞数分别为（312 ± 29）、（487 ± 53）个，敲低组穿膜细胞数低于对照组（t=5.02，P＜0.05）；在Transwell 迁移实验中，敲低组与对照组穿膜细胞数分别为（253 ± 26）、（394 ± 42）个，敲低组穿膜细胞数低于对照组（t=4.94，P＜0.05）。

2.5 敲低lncRNA MIR31HG 对HCC 细胞EMT 相关蛋白表达的影响 见表1。

表1 两组EMT相关蛋白相对表达量比较（-x ± s）

2.6 lncRNA MIR31HG 与miR-361 的靶向调控关系预测与验证结果 经LncBase V. 2 在线软件预测，lncRNA MIR31HG 存在与miR-361 的结合位点，见图1。

图1 lncRNA MIR31HG与miR-361的结合位点示意图

双荧光素酶报告基因实验结果显示，转染MIR31HG WT + miR-361 mimics、MIR31HG WT + NC mimics、MIR31HG MUT + miR-361 mimics、MIR31HG MUT + NC mimics 的HCC 细胞荧光素酶活性分别为0.36 ± 0.07、1.01 ± 0.03、1.02 ± 0.04、0.99 ± 0.05。转染MIR31HG WT + miR-361 mimics的HCC细胞荧光素酶活性低于转染MIR31HG WT + NC mimics 的HCC 细胞（t=14.78，P＜0.05），而转染MIR31HG MUT + miR-361 mimics与MIR31HG MUT + NC mimics的HCC细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义（t=0.81，P＞0.05）。

3 讨论

HCC 是世界上第五大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因。尽管在过去几十年里HCC 的治疗取得了很大进展，但手术切除仍然是其首选的治疗方法。由于术后易复发和转移，HCC 患者5 年生存率仅约30%，预后较差。目前，HCC 发生、发展的确切分子机制尚不完全清楚。因此，阐明HCC 发生、发展的分子机制，对研发特异性靶向治疗药物具有重要意义。

lncRNA 是一类长度超过200 bp、无长开放阅读框的内源性非编码RNA。虽然lncRNA 不具备蛋白质编码能力，但其在各种生物学过程的调控中发挥重要作用。lncRNA 已被确定为表观遗传学机制中的重要调节因子，这些表观遗传学机制涉及组蛋白修饰、DNA 甲基化、转录调节和转录后调节等。近年研究发现，lncRNA 功能失调与肿瘤的发生、侵袭、转移以及治疗耐药密切相关［10］。在恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方面，lncRNA 的应用前景越来越受到关注。CAO 等［11］研究发现，lncRNA ZEB2-19 可通过TRA2A/RSPH14 轴减弱NF-κB 信号通路，从而抑制HCC 进展并缓解乐伐替尼的耐药性。ZENG 等［12］研究报道，lncRNA SLC7A11-AS1 通过介导KLF9 泛素化而促进HCC 进展。近年陆续发现一些lncRNA与HCC发生和转移有关，但至今尚未发现在HCC发生和转移过程中起关键性作用的lncRNA［13］。MIR31HG 是近年新发现的一种lncRNA，可在多种恶性肿瘤细胞中异常表达，能够影响肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡以及EMT 等生物学过程。近年研究发现，lncRNA MIR31HG 在胃癌［14］、胰腺癌［15］、甲状腺癌［16］、乳腺癌［17］等恶性肿瘤细胞中高表达，可能具有促癌基因作用。但在膀胱癌细胞中发现MIR31HG 低表达，可能具有抑癌基因作用［18］。以上研究表明，lncRNA MIR31HG 在不同恶性肿瘤中具有明显的异质性，可能通过不同的信号通路而发挥作用。但迄今为止lncRNA MIR31HG 在HCC 中的研究甚少，并且其作用机制尚不明确。

本研究通过RT-qPCR 法检测了MHCC97H、MHCC97L、LO2细胞中lncRNA MIR31HG表达，结果发现，MHCC97H、MHCC97L 细胞lncRNA MIR31HG表达明显高于LO2 细胞，并且MHCC97H 细胞lncRNA MIR31HG 表达明显高于MHCC97L 细胞，提示lncRNA MIR31HG 在HCC 的发生、发展中可能具有促癌基因作用。本研究通过脂质体转染法敲低MHCC97H 细胞lncRNA MIR31HG 表达，并通过RT-qPCR 法验证，发现敲低组lncRNA MIR31HG 表达低于对照组，表明本研究成功敲低了MHCC97H细胞lncRNA MIR31HG。进一步研究发现，敲低组细胞黏附、侵袭和迁移能力均明显低于对照组，上皮标志物E-cadherin 蛋白表达明显高于对照组，而间质标志物N-cadherin、Fibronectin 蛋白表达明显低于对照组。表明敲低lncRNA MIR31HG能够抑制HCC细胞的黏附、侵袭和迁移以及EMT。进一步证实lncRNA MIR31HG 在HCC 的发生、发展中起着促癌基因作用。

lncRNA 作为ceRNA 可通过与miRNA 竞争性结合，从而影响下游miRNA 对其靶基因的调控。目前，在宫颈癌［7］、骨肉瘤［8］、结肠癌［9］等恶性肿瘤细胞的研究中发现，lncRNA MIR31HG 能够竞争性结合miR-361 的3'UTR，从而干扰miR-361 对靶基因的调控，继而影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。有研究报道，miR-361在HCC细胞中表达降低，上调miR-361表达则能抑制HCC 细胞的增殖、侵袭、迁移以及EMT［4-6］。本研究结果发现，MHCC97H、MHCC97L细胞miR-361 表达明显低于LO2细胞，并且MHCC97H细胞miR-361 表达明显低于MHCC97L 细胞。经LncBase V.2 在线软件预测，lncRNA MIR31HG 存在与miR-361 的结合位点；双荧光素酶报告基因实验显示，lncRNA MIR31HG能够与miR-361的3'UTR特异性结合，从而抑制其荧光素酶活性。结果提示，lncRNA MIR31HG 对HCC 细胞黏附、侵袭和迁移的影响可能与靶向调控miR-361有关。

综上所述，HCC细胞lncRNA MIR31HG高表达；敲低lncRNA MIR31HG 则能抑制HCC 细胞的黏附、侵袭和迁移以及EMT，其机制可能与lncRNA MIR31HG能够靶向调控miR-361有关。