食管癌组织DPP3、SMAC 表达变化及其与临床病理特征和预后的关系

朱强，孙彦龙，武毅，王海，王玉璇

1 山西白求恩医院（山西医学科学院 同济山西医院） 山西医科大学第三医院胸外科，太原 030032；2 华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科

食管癌是全球第八大常见癌症和第六大癌症相关死亡原因。据报道，2020 年全球食管癌新发病例约60.4 万例、死亡病例约54.4 万例，其中超过一半的新发病例和死亡病例发生在中国［1］。食管癌预后较差，通常5 年生存率不足30%。目前，临床尚缺乏评估食管癌预后的生物标志物。研究表明，金属肽酶异常表达和线粒体功能障碍在肿瘤的发生、发展中具有重要作用［2-3］。二肽基肽酶Ⅲ（DPP3）是一种锌依赖的金属肽酶，可作为重要枢纽与蛋白产生交互作用，从而参与调控细胞的增殖、迁移和凋亡等生物学过程［4］。第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（SMAC）是一种线粒体膜间隙蛋白，可通过拮抗细胞凋亡抑制蛋白（cIAP）而促进细胞凋亡［5］。有研究报道，DPP3、SMAC 异常表达与食管鳞癌细胞的恶性增殖、侵袭和迁移等有关［6-7］。但目前鲜有食管癌组织DPP3、SMAC 表达变化的报道。鉴于此，本研究探讨了食管癌组织DPP3、SMAC 表达变化及其与临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016 年8 月—2020 年8 月山西白求恩医院胸外科收治的101 例食管癌患者。纳入标准：①符合食管癌诊断标准；②初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；③接受根治性或姑息性手术治疗；④年龄≥18 岁；⑤临床病理资料完整。排除标准：①合并胃食管反流、反流性食管炎、感染性食管炎等其他食管疾病者；②合并重要脏器严重疾病者；③合并急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病者；④合并其他部位恶性肿瘤者；⑤合并精神疾病者。其中，男72 例，女29 例；年龄29～75（65.54 ± 7.66）岁，≥60 岁64 例、＜60 岁37 例；有吸烟史47 例，有饮酒史45例；肿瘤部位：颈段14例，胸上段21例，胸中段59例，胸下段7 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期50 例，Ⅲ期51例；病理类型：腺癌10例，鳞癌91例；组织分化程度：低分化46 例，中高分化55 例；有淋巴结转移37 例。本研究经山西白求恩医院伦理委员会批准（审批编号：YXLL-2022-130）。所有研究对象或其家属对本研究知情并签署书面知情同意书。

1.2 DPP3、SMAC表达检测 采用免疫组化法。取术中切除的食管癌组织及其癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞2 cm，经组织病理检查确定为正常食管组织），常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，3 µm 厚连续切片。然后将切片置于60 ℃烤箱烤片30 min，脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液高温高压修复抗原，3% H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化酶。5%山羊血清封闭，然后滴加DPP3、SMAC一抗，4 ℃孵育过夜。次日，滴加HRP标记的二抗，37 ℃孵育30 min。DAB 显色，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下拍照观察。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。

由两位病理科医师采用双盲法独立阅片。DPP3阳性染色定位于细胞质和细胞核，呈棕黄色颗粒；SMAC 阳性染色定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。染色强度评分：以阳性细胞呈色反应为准，无着色为0 分、浅黄色为1 分、棕黄色为2 分、棕褐色为3 分。每张切片随机选择5个200倍视野，计数阳性细胞数和细胞总数，计算阳性细胞比例。阳性细胞比例评分：无阳性细胞为0 分、阳性细胞比例＜5%为1 分、阳性细胞比例5%～＜30%为2 分、阳性细胞比例30%～＜50%为3分、阳性细胞比例≥50%为4分。根据染色强度和阳性细胞比例半定量分析，以染色强度评分与阳性细胞比例评分的乘积综合评价。二者乘积≥4为阳性表达。

1.3 随访 食管癌患者出院后通过电话、门诊、网络等方式定期随访3年，随访截至2023年8月31日，统计患者生存情况。终点事件为患者死亡、失访或至随访截至日期。

1.4 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织与癌旁正常组织DPP3、SMAC阳性表达率比较 食管癌组织DPP3、SMAC 阳性表达率分别为78.22%（79/101）、54.46%（55/101），癌旁正常组织分别为28.71%（29/101）、90.10%（91/101）。食管癌组织DPP3 阳性表达率高于癌旁正常组织，SMAC 阳性表达率低于癌旁正常组织（χ2分别为49.744、32.020，P均＜0.05）。

2.2 食管癌组织DPP3、SMAC 阳性表达与临床病理特征的关系 见表1。

表1 食管癌组织DPP3、SMAC阳性表达与临床病理特征的关系

2.3 食管癌组织DPP3、SMAC表达与预后的关系 随访3年，101例食管癌患者无失访病例，期间死亡33例，总生存率为67.33%（68/101）。生存曲线分析显示，DPP3阳性表达者3年生存率为60.76%（48/79），其阴性表达者为90.91%（20/22）；SMAC 阳性表达者3年生存率为80.00%（44/55），其阴性表达者为52.17%（24/46）。DPP3 阳性表达者3 年生存率低于其阴性表达者，SMAC阳性表达者3年生存率高于其阴性表达者（Log-rankχ2分别为6.342、10.811，P均＜0.05）。

3 讨论

食管癌是我国发病率较高的一种消化系统恶性肿瘤，其恶性程度较高，预后较差。根治性手术仍然是目前食管癌的首选治疗方法。但食管癌早期症状不明显且无特异性，超过50%患者就诊时已进展至中晚期，往往错过了根治性手术的最佳时机，即使经多种方法综合治疗，5年生存率也仅30%左右［8］。目前，食管癌的病因和发病机制尚不完全清楚。因此，深入探索食管癌发病的分子机制对其早期诊断、靶向治疗和预后评估具有重要意义。

金属肽酶是一类催化蛋白质中肽键水解的蛋白酶，一直被认为在蛋白质更新代谢中的作用微不足道。但近年研究发现，金属肽酶可调控细胞的增殖和凋亡，其失调会导致肿瘤、心血管疾病、神经损伤等一系列疾病发生［9］。DPP 属于锌依赖性水解酶家族，DPP3是该家族中唯一在金属结合基序中具有独特螺旋部分的成员。这种结构使得DPP3 中的锌离子配位几何结构高度灵活，能更好地与其他蛋白相互作用，从而参与多种病理生理过程［10］。DPP3最早被认为是氧化应激的调节剂，能够通过激活Kelch样ECH 相关蛋白1/核因子红系2 相关因子2（NRF2）信号通路发挥抗氧化应激作用，从而参与心血管疾病的发生、发展［11］。LU 等［12］研究报道，DPP3能够通过上调NRF2 下游基因的表达而增强乳腺癌细胞的恶性生物学行为，并且与乳腺癌患者预后不良有关。TONG 等［13］研究报道，DPP3 能够通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶1促进结直肠癌细胞的增殖、迁移并抑制其凋亡，并且与结直肠癌患者预后不良有关。而ARORA 等［6］研究指出，DPP3 高表达能够促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。因此推测，DPP3表达可能与食管癌患者预后有关。本研究结果显示，食管癌组织DPP3 阳性表达率高于癌旁正常组织；食管癌组织DPP3 阳性表达与组织分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关；DPP3 阳性表达者3 年生存率低于其阴性表达者。本研究结果与ARORA 等［6］报道基本一致，提示DPP3 高表达可能与食管癌的恶性进展有关。究其原因，DPP3高表达能够上调细胞质接头体相关蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白2、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体等抗凋亡蛋白表达，下调p53等促凋亡蛋白表达，导致食管癌细胞的恶性生长和增殖，从而促进食管癌的发生、发展［14］；同时，DPP3 高表达还能激活NRF2信号通路，通过维持肿瘤细胞内氧化还原稳态和增强肿瘤细胞代谢重编程，促进食管癌细胞增殖并抑制其凋亡，从而导致食管癌的发生、发展［6］。

线粒体被称为细胞的“动力工厂”，其稳态对维持机体生理功能至关重要。线粒体结构或功能异常则会导致包括肿瘤在内的多种疾病发生［3］。线粒体凋亡通路是构成细胞凋亡信号传导的重要通路之一，在不同环境中发挥促进细胞存活或诱导细胞凋亡的功能。但肿瘤细胞内线粒体数量、结构和功能异常改变导致其诱导凋亡的能力降低，进而促进了肿瘤的发生、发展［15］。SMAC 是近年新发现的一种线粒体蛋白质，在线粒体凋亡程序启动时释放。SMAC 能够通过与半胱氨酸蛋白酶竞争性结合cIAP1、cIAP2 并通过自身泛素化降解cIAP1、cIAP2，通过与cIAP相互拮抗而发挥促细胞凋亡作用［6］。在胰腺癌、结直肠癌细胞模型中，上调SMAC 表达能够激活线粒体凋亡通路，增强阿霉素的抗肿瘤作用［16］。此外，上调SMAC 表达还能激活卵巢癌细胞半胱氨酸蛋白酶3 凋亡通路，抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭并诱导其凋亡［17］。本研究结果显示，食管癌组织SMAC 阳性表达率低于癌旁正常组织；食管癌组织SMAC阳性表达与组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关；SMAC阳性表达者3年生存率高于其阴性表达者。本研究结果与既往研究［8］报道基本一致，提示SMAC 低表达可能与食管癌的发生、发展密切相关。究其原因，SMAC 低表达抑制了线粒体凋亡通路介导的细胞凋亡作用，导致食管癌细胞的恶性生长和增殖；而线粒体作为参与能量代谢的重要细胞器，肿瘤细胞内线粒体功能异常不仅能抑制线粒体凋亡通路，还能增强线粒体介导的Warburg 效应，持续为食管癌细胞恶性生长和增殖提供所需的能量，以满足其在缺氧或酸性环境中快速生长和增殖的需要［18］。

综上所述，食管癌组织DPP3 高表达、SMAC 低表达，二者表达变化与组织分化程度、TNM 分期、淋巴结转移和预后不良密切相关。