miR-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响

常云丽，胥明，陈国裕，汤杰，陈玲玲，季洁如

上海市浦东新区人民医院消化内科，上海 201299

结肠癌是全球范围内发病率和死亡率均居前五位的恶性肿瘤，好发于40 岁以上中老年人，并且男性多于女性［1-2］。目前，针对结肠癌的治疗方法有多种，但总体预后仍然较差［3］。因此，深入探索结肠癌发病的分子机制，从而实现精准治疗，对提高患者预后具有重要意义［4］。既往研究报道，遗传因素是导致结肠癌出现家族聚集的重要原因［5］。微小核糖核酸（miRNA）是一类长度为21～25 个核苷酸的非编码小分子RNA，可在表观遗传学水平上调控基因的表达。miRNA 异常表达与多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关，并对肿瘤干细胞的功能维持和分化方向具有重要的调节作用［6］。作为miRNA 家族成员之一，miR-7 能够调控多种靶基因的表达，从而抑制肝癌、肺癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展［7］。Krüppe样因子4（KLF4）是诱导多潜能干细胞形成所需的关键因子之一，在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中发挥重要作用。有研究发现，miR-7/KLF4 信号轴能够参与牙周膜干细胞的成骨与分化［8］。但目前鲜见miR-7/KLF4 信号轴在结肠癌干细胞中作用的研究报道。2020年1月—2022年12月，本研究探讨了miR-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌干细胞，由本院外科手术切除的结肠癌组织中分离获得，并于液氮罐中保存备用。引物序列、miR-7 mimics 质粒及其空载质粒（NC mimics）均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。倒置显微镜，购自日本OLYMPUS 株式会社；微孔板阅读器，购自美国GE HealthCare公司；iBright凝胶成像系统、流式细胞仪，购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。原代细胞质粒DNA 转染试剂盒，购自湖北艾普蒂生物工程有限公司；CCK-8，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司；RNA 转录、提取及荧光定量试剂盒，购自美国Sigma 公司；KLF4、β-actin 一抗，购自美国Abcam 公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗，购自上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.2 细胞培养 取出液氮罐中保存的结肠癌干细胞，37 ℃水浴复苏。将复苏后的结肠癌干细胞接种于含10% FBS 的RPMI 1640 培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱常规培养。每3天更换一次培养基。当细胞生长至70%以上融合时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代。

1.3 细胞转染 取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞，接种于6孔板，每孔1 × 106个，随机分为对照组、NC mimics组、miR-7 mimics 组，每组设6 个复孔。将6 孔板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱常规培养。培养24 h，按原代细胞质粒DNA转染试剂盒说明，NC mimics 组和miR-7 mimics 组分别转染空载质粒、miR-7 mimics 质粒；对照组常规培养，不予转染。转染48 h，收集细胞，按RNA 提取试剂盒说明提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按RNA逆转录试剂盒说明，将总RNA 逆转录合成为cDNA。以cDNA为模板，按实时荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR 扩增。引物序列：miR-7 上游引物5'-CGTAGTGCTGTAGCTAGTCGTA-3'、下游引物5'-TTGTGCTAGTGCTAGTCCGT-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGAGATAGCTGCTGTGAT-3'、下游引物5'-CTGATGTGTTAATATTCGTGTCA-3'。PCR 反应体系共30 µL：SYBR Green qPCR SuperMix 15.00 µL，cDNA 模板3.50 µL，上下游引物各1.50 µL，DEPC水8.50 µL；反应条件：96 ℃ 3 min，96 ℃ 10 s、65 ℃ 4 s、72 ℃ 40 s共40个循环。PCR 扩增反应完成后，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.4 细胞活力检测 采用CCK-8 法。收集各组转染48 h 结肠癌干细胞，接种于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，每孔加入CCK-8 溶液10 µL，室温孵育3 h。然后通过微孔板阅读器检测450 nm 波长处各孔的光密度（OD）值，按公式计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔OD450值-空白对照孔OD450值）/（对照孔OD450值-空白对照组OD450值） × 100%。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。收集各组转染48 h 结肠癌干细胞，按5 × 105/mL 密度接种于6孔板。将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养48 h。用微量加样器枪头垂直在各培养孔中央作一划痕。继续培养48 h，倒置显微镜下拍照观察，按公式计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 划痕距离-48 h 划痕距离）/0 h 划痕距离 × 100%。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用改良Boyden 小室法。收集各组转染48 h 结肠癌干细胞，取1 × 105个接种于用Matrigel 基质胶包被的Boyden 小室上室，Boyden小室下室加入含10% FBS的RPMI 1640培养基。然后将Boyden 小室放入6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。常规培养24 h，取出滤膜，用棉签擦去上室面残留细胞，甲醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜下拍照，随机选取5 个不重叠视野，计数每视野穿膜细胞数。

1.7 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。收集各组转染48 h 结肠癌干细胞，接种于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养。常规培养24 h，用1 × Binding Buffer 重悬，制成密度为1 × 106/mL 细胞悬液。取细胞悬液100 µL，加入Annexin V-FITC 5 µL混匀，室温避光孵育15 min；再加入PI 10 µL混匀，4 ℃避光孵育5 min；最后加入1 × Binding Buffer 400 µL混匀，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 miR-7与KLF4的靶向结合位点预测与验证 通过TargetScan 在线网站（http：//www.targetscan.org）预测miR-7 与KLF4 的结合位点。取传15 代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞，接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，按原代细胞质粒DNA 转染试剂盒说明，将KLF4-WT（野生型）、KLF4-MUT（突变型）分别与NC mimics 或miR-7 mimics 共转染结肠癌干细胞。转染48 h，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9 KLF4 表达检测 ①KLF4 mRNA 表达检测：收集各组转染48 h 结肠癌干细胞，采用RT-qPCR 法检测KLF4 mRNA 相对表达量，具体步骤参照1.3。引物序列：KLF4 上游引物5'-GTTCGTAGCTGATCGTCGTAGCTA-3'、下游引物5'-TATGTAGTGTCGTGCTGTAGC-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGAGATAGCTGCTGTGAT-3'、下游引物5'-CTGATGTGTTAATATTCGTGTCA-3'。②KLF4 蛋白表达检测：收集各组转染48 h结肠癌干细胞，提取细胞总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。加入上样缓冲液，100 ℃水浴充分变性。取变性蛋白，SDS-PAGE 分离。电泳结束，转印至PVDF 膜上。然后用脱脂奶粉室温封闭，分别加入KLF4、β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗，室温孵育2 h，iBright凝胶成像系统曝光并分析结果。

1.10 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率验证结果 对照组、NC mimics 组、miR-7 mimics 组miR-7 相对表达量分别为1.00 ±0.00、1.02 ± 0.07、1.89 ± 0.17。miR-7 mimics 组miR-7相对表达量高于对照组和NC mimics组（P均＜0.05），而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 三组细胞活性、细胞迁移和侵袭能力以及细胞凋亡率比较 见表1。

表1 三组细胞活性、细胞迁移和侵袭能力以及细胞凋亡率比较（xˉ± s）

2.3 miR-7 与KLF4 的靶向结合位点预测与验证结果 经TargetScan在线网站预测，KLF4基因的3'非翻译区存在miR-7的结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染NC mimics 与KLF4-WT及共转染miR-7 mimics 与KLF4-WT 的结肠癌干细胞荧光素酶活性分别为1.04 ± 0.05、1.53 ± 0.12，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；共转染NC mimics 与KLF4-MUT 及共转染miR-7 mimics 与KLF4-MUT 的结肠癌干细胞荧光素酶活性分别为1.01 ± 0.07、1.04 ± 0.06，二者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 miR-7与KLF4的靶向结合位点示意图

2.4 三组KLF4 mRNA和蛋白表达比较 见表2。

表2 三组KLF4 mRNA和蛋白相对表达量比较（xˉ± s）

3 讨论

据报道，在全球范围内结肠癌是发病率和死亡率均居前五位的恶性肿瘤，每年新发病例超过190万例、死亡病例超过90 万例［9］。我国是结肠癌负担较重的国家，结肠癌的发病率为15/10 万～25/10万、死亡率为7/10 万～13/10 万［10］。目前对于结肠癌的发病机制尚未完全阐明。因此，深入探索结肠癌发病的分子机制，对寻找早期诊断的生物标志物和治疗靶点具有重要意义。

遗传因素在结肠癌的发生、发展中起重要作用。miRNA 是一类非编码单链小RNA 分子，目前已证实其与肿瘤的发生、发展密切相关。miR-7 是miRNA 家族成员之一，定位于人9 号染色体异构核蛋白K 基因的第一个内含子中。miR-7 可在大脑、眼睛和胰腺等部位高表达，提示miR-7 在这些器官的发育中具有重要作用［11］。有研究发现，在胶质母细胞瘤中miR-7低表达，而miR-7过表达则可通过靶向EGFR、AKT 而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移［12］。但目前鲜见miR-7 在结肠癌干细胞中作用的报道。本研究结果发现，miR-7 mimics组miR-7相对表达量高于对照组和NC mimics 组，而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义，提示该方法成功将miR-7转染至结肠癌干细胞中。进一步研究发现，miR-7 mimics组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数均低于NC mimics组和对照组，细胞凋亡率高于NC mimics组和对照组；NC mimics 组与对照组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义。结果表明，miR-7 能够参与结肠癌干细胞的恶性生物学行为，上调miR-7 表达则可抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

KLF4 是诱导多潜能干细胞形成所需的关键因子之一，在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中发挥重要作用。有研究发现，miR-7/KLF4信号轴能够参与牙周膜干细胞的成骨与分化［8］。但目前鲜见miR-7/KLF4 信号轴在结肠癌干细胞中作用的报道。本研究在筛选miR-7 作为靶基因后，发现miR-7 的下游靶点较多，如KLF4、EGFR、IRS-1、PAK-1、RAF-1 和SATB1 等，它们均参与肿瘤发生、发展中的关键信号传导［13］。因此，本研究将miR-7的调控机制锁定在其上下游靶基因中。有研究报道，沉默KLF4 可降低肿瘤干细胞比例，而其过表达则可导致肿瘤干细胞比例增加，表明KLF4 在肿瘤的发生、发展中具有强大的致癌作用，但其具体作用机制尚不清楚［14］。有研究在结肠癌中发现KLF4 过表达，并将其确定为早期侵袭性表型的标志［15］。作为一种转录因子，KLF4 可通过抑制p53 转录来阻止细胞衰老和凋亡，这可能是KLF4 过表达后肿瘤细胞凋亡率降低的原因之一［16］。本研究结果发现，KLF4基因的3'非翻译区存在miR-7 的结合位点；经双荧光素酶报告基因实验验证，miR-7 能够靶向调控KLF4。进一步研究发现，miR-7 mimics 组KLF4 mRNA 与蛋白相对表达量均低于NC mimics 组和对照组，而NC mimics 组与对照组比较差异均无统计学意义。提示miR-7 可能通过靶向下调KLF4 表达而抑制结肠癌干细胞的恶性生物学行为。

综上所述，miR-7 可能通过靶向下调KLF4 表达而抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。