基于熵权TOPSIS法综合评价三叶青叶的采收期*

杨 楠 洪玉燕 潘梦婷 许 文 徐惠龙 范世明

三叶青(Tetrastigmahemsleyanum.Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤,别名金线吊葫芦、石猴子等[1],即福建、浙江习用传统中药“一粒珠”[2],也是福建省特色畲药[3]。三叶青含有酚酸类、黄酮类等成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用[4,5]。三叶青药用价值高,其块根市场供不应求,其叶产量较为稳定,但不同采收期对其活性成分累积影响较大。研究不同采收期对明确三叶青叶中有效成分的变化规律具有重要意义。目前三叶青采收期研究主要集中在块根,且1～4月均可采收[6]。本研究建立UPLC-MS/MS法同时测定三叶青叶中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷、异荭草素鼠李糖苷、荭草素鼠李糖苷、绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸的含量。以有效成分与生物量为评价指标,结合熵权TOPSIS法对不同采收期的三叶青叶进行评估,为三叶青叶质量评价和开发利用研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司),Xevo TQ-S三重四级杆质谱(美国Waters公司),CPA225D型半微量天平(德国Sartorius公司),BSA224S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司),KQ-500E台式超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司),FY135型中药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司),HC-2068高速离心机(安徽中佳科学仪器有限公司)。

1.2 材料本研究样品采自福建中医药大学药用植物园,由福建中医药大学范世明正高级实验师鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的叶片。对照品牡荆苷(MUST-16030811)、异牡荆苷(MUST-15071112)、荭草苷(MUST-13070502)、异荭草苷(MUST-13100902)购于成都曼思特生物科技有限公司,牡荆素鼠李糖苷(Y130506)、异牡荆素鼠李糖苷(64820991)、荭草素鼠李糖苷(44257931)、异荭草素鼠李糖苷(50993776)、绿原酸(327979)、新绿原酸(906332)、隐绿原酸(905997)购于北京赛百草科技有限公司。内标甘草苷(MUST-14100910)购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈(色谱纯);其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Waters CORTECS©UPLC©C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脱(0～0.5 min,A=5%;0.5～1.5 min,5%A→9%A;1.5～4.5 min,9%A→11%A;4.5～6.5 min,11%A→12.5%A;6.5～9.6 min,A=12.5%;9.6～10.4 min,12.5%A→20%A;10.4～10.5 min,20%A→5%A;10.5～12 min,A=5%);进样量:2 μl;流速:0.25 ml/min;柱温:45 ℃。

2.2 质谱条件电喷雾正负离子模式;毛细管电压3.5 kV(正离子模式)和2.5 kV(负离子模式);脱溶剂气流(氮气)流速800 L·Hr-1;脱溶剂温度500 ℃;离子源温度150 ℃;锥孔气流(氮气)流速50 L·h-1;二级锥孔萃取电压:3.00 V;停留时间:5 ms;碰撞气体氩气;载气:氮气。采用MRM定量模式,11种分析物及内标的质谱分析条件参数见表1。

表1 11个成分及内标的质谱测定条件

2.3 对照品溶液的制备分别精密称取牡荆苷、异牡荆苷、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷、荭草素鼠李糖苷、异荭草素鼠李糖、新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸对照品适量,用甲醇制成浓度约为1.259、0.985、1.468、0.966、0.879、0.942、0.886、1.251、0.752、0.794、1.510 mg/ml的单一对照品储备液,其他不同浓度对照品溶液由10%甲醇稀释得到,内标液为甘草苷(100 ng/ml)。

2.4 供试品溶液的制备将三叶青叶粉碎,过40目筛,精密称取0.1 g,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml,密塞,称定重量,超声(功率250 W,频率50 kHz)提取30 min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失重量,摇匀,取适量提取液12 000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,滤液为样品溶液和内标液按1∶9(100 μl∶900 μl)混合均匀进行测定。

2.5 熵权TOPSIS法模型的建立建立原始评价矩阵:以三叶青中酚酸类成分含量、黄酮类成分含量、生物量为评价指标,原始矩阵公式为:

A=(χij)m×n

(1)

χij为第j个指标下第i个项目的评价值,m为采收月份(m=12),n为评价指标(n=3)。2)建立标准归一化决策矩阵:本研究中的3个指标均为正向化指标,但各指标量纲不一,需进行归一化处理,公式为:

(2)

3)熵权法[7]:以归一化数据计算各指标的信息熵(ej)、信息效用值(hj)、熵权系数(Wj),公式分别为:

(3)

hi=1-ej

(4)

(5)

4)建立TOPSIS法[7]:首先确定评价指标的正理想解(A+)和负理想解(A-):

(6)

接着计算出各评价指标分别与正负理想解的距离值D+和D-,最终计算得出评价指标与最优方案的接近度(Ci值),根据Ci值大小排序来评定三叶青叶的最佳采收期。计算公式如下:

(7)

(8)

2.6 方法学考察

2.6.1 质谱测定方法三叶青样品和混合对照品溶液按照上述色谱及质谱条件下分析得三叶青的UPLC-MS/MS色谱图,11种化合物和内标均能在各自通道中分离良好。见图1。

注:1.新绿原酸;2.绿原酸;3.隐绿原酸;4.异荭草苷;5.荭草苷;6.牡荆苷;7.异牡荆苷;8.异荭草素鼠李糖苷;9.荭草素鼠李糖苷;10.甘草苷11.牡荆素鼠李糖苷;12.异牡荆素鼠李糖苷。图1 空白(A)对照品(B)三叶青叶(C)色谱图

2.6.2 线性与范围取各对照品储备液,用10%甲醇稀释系列梯度浓度的对照品混合溶液,测定前对照品溶液和内标溶液按1∶9混合均匀测定。以对照品峰面积与内标峰面积的比值(Y)对分析物浓度(X)作线性回归,绘制标准曲线,得到回归方程和相关系数,并以信噪比10计算定量限(LOQ),以信噪比3计算检测限(LOD)。见表2。

2.6.3 精密度实验精密吸取线性最低浓度点、低、中、高混合对照品溶液1 μl,一天内连续进样6 次,及连续6 天测定,根据标准曲线计算浓度,其日内精密度和日间精密度RSD均在1.13%～4.78%,表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性实验精密称取同一批(201601)三叶青叶6份,按供试品制备方法进行制备,分别在室温下放置0、4、8、12、18和24 h进行测定,根据标准曲线计算浓度,其RSD均在3.58%～4.92%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.5 重复性实验精密称取同一批(201601)三叶青叶6份,按供试品制备方法进行制备,依法测定,11种成分含量的RSD均在4.53%以内,表明重复性良好。

2.6.6 回收率实验精密称取重复性实验已知含量三叶青叶约0.05 g,近似1∶1分别加入11个对照品,重复6次,按供试品制备方法进行制备,依法测定,计算各个成分回收率范围在98.09%～101.16%,其RSD范围均在2.22%～3.20%,表明方法回收率符合分析要求。

2.7 不同采收期的酚类含量与生物量的动态变化11种成分在12个采收期呈不同的变化规律(见图2),牡荆苷和异牡荆苷变化趋势为1月份开始急速上升,2月份达到峰值后下降,6月份后含量最低,均小于0.0562 mg/g;异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷均在3～5月份含量较高,随后含量逐渐下降。荭草素鼠李糖苷、异荭草素鼠李糖、新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸积累趋势基本趋于一致,5月份含量最高,6月份突然降低即出现上升后下降的循环。三叶青叶生物量累积在4～6月份呈上升趋势,6月份出现峰值,7～11月份保持较高水平。

注:不同小写字母表示不同月份之间的比较,P<0.05。图2 不同月份采收的三叶青叶中11个成分含量及生物量动态变化

2.8 熵权TOPSIS法综合评价分析熵权TOPSIS法是以标准化处理的评价指标为基础通过计算权重,来体现各指标的重要程度,同时将无量纲化的指标通过计算正负理想解和相对贴近度综合评价最佳采收期[8,9]。各指标权重结果为信息熵值e={0.8602,0.8984,0.8532};信息效用值h={0.1398,0.1016,0.1468};权重系数Wj={36.02%,26.17%,37.81%};说明生物量是采收期评价分析中的重要因素。TOPSIS法计算得到D+、D-及评价指标与最优方案的接近度(Ci值),结果见表3,排名靠前为5月、6月、4月,7月,因此三叶青叶的采收期以4～7月份为最佳。

表3 不同采收期三叶青叶综合评价排序

3 小结

课题组前期通过研究三叶青叶中有效成分发现叶中酚类成分含量较高,尤其是总黄酮[10,11]。因此本研究对8个黄酮类成分和3个酚酸类成分的含量进行测定,结果牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷、荭草素鼠李糖苷和绿原酸在三叶青叶中含量均较高,牡荆苷、异牡荆苷、异荭草苷和隐绿原酸含量相对较低。11种成分含量随时间变化有所差异,但基本符合3～5月份含量最高,其他月份含量较低。三叶青从11月下旬至次年2月进入休眠期,基本停止生长,从3月下旬开始逐渐萌发新枝叶,此阶段三叶青逐步解除休眠,抽发新芽,确保植株的正常生长,有效成分积累较高,到5月达到峰值,6～8月份为夏季,三叶青生长旺盛,进入快速生长阶段[12]。在实际采收过程中6月份生物量最高,黄酮类和酚酸类成分含量在3～5月份较高,符合植物生长规律。为了更好地分析三叶青叶的最佳采收期,利用熵权TPOSIS法对叶片有效成分和生物量进行综合评价,三叶青叶在5月份采收最优,4、6、7月份采收次之,中药材适宜采收期的确立既要重视指标性化学成分体系的选择,同时也要注重其药用部位的生物产量,以实现药材生产的质量最优和产量最大化原则。故建议在4～7月份采收最佳。