嵌套EP管法更快速获取更多小鼠骨髓细胞①

徐启英 王卓亚 冶 怡 乌仁塔娜

（青海大学高原医学研究中心，高原医学教育部重点实验室，青海省高原医学应用基础重点实验室，青海-犹他高原医学联合重点实验室，西宁 810001）

小鼠是生命科学研究最常用的实验动物，它们被广泛应用于发病机制研究、药物筛选。长骨和骨髓细胞研究是无数研究学科的中心，包括但不限于骨生物学、癌症生物学、免疫学、血液学和生物力学，其中，小鼠骨髓细胞在免疫、造血系统相关实验中至关重要［1-2］。寻求一种高骨髓细胞回收率的标准化骨髓分离方法对于流式活细胞分选、定量PCR及骨髓细胞的原代细胞培养是非常重要的。目前，原代小鼠骨髓细胞提取主要是在取出小鼠股骨、胫骨后，利用1 ml 注射器或26G 针头吸取相关培养基再将骨髓细胞冲洗到15 ml 无菌离心管中，本研究所用的嵌套EP管法，能更快速地获取更多的小鼠骨髓细胞［3-4］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实 验 动 物 雄 性SPF 级C57/BL6 小 鼠，6～8周龄，18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCKK（京）2020-0004，质量合格证：110322200101810883。饲养于青海大学高原医学研究中心动物房屏障环境中。饲养环境恒温恒湿，光照黑暗交替12 h，适应性饲养1 周后用于实验。所有动物实验经青海大学附属医院动物实验伦理委员会审批（SL-2020091）。

1.1.2 主要试剂 细胞活性检测Zombie AquaTMFixable Viability Kit 及红细胞裂解液购自Biolegend公司，RPMI1640 及胎牛血清购自Gibco 公司；CCK-8购自ELabscicence公司。

1.2 方法

1.2.1 嵌套EP管法获取小鼠骨髓细胞 使用50 ml注射器针头于500 μl EP管底部戳一圆形小孔，消毒后备用（图1A）。麻醉后将小鼠仰面固定于一个消毒托盘上，心包取血/腹主动脉放血处死小鼠。游离出小鼠双下肢，剔尽小鼠双下肢肌肉。分离双侧股骨、胫骨，将其浸入含75%乙醇的5 ml离心管中45 s，转入超净台中，将股骨、胫骨移至含无菌PBS的5 ml离心管中。使用手术刀刮净小鼠股骨、胫骨肌肉及结缔组织，于股骨、胫骨一端切断骨组织，暴露骨髓腔，将裸露骨髓腔部分向下置于准备好的无菌带洞500 μl EP 管中，盖上管盖，将其嵌套入含有100 μl培养基的1.5 ml EP 管中（图1B），使用离心机高速离心10 s，获得小鼠骨髓细胞（图1C）。

图1 嵌套EP管法获取小鼠骨髓细胞Fig.1 Mouse bone marrow cells were obtained by nested EP tube

1.2.2 注射器冲洗法获取小鼠骨髓细胞 同

1.2.1 方法获得小鼠双下肢后，剥离肌肉及结缔组织，分离股骨、胫骨，分别剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔，取内含PBS或培养基的1 ml注射器，将针头轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15 ml 离心管，反复冲洗将细胞冲出，1 500 r/min 离心5 min，即可获取骨髓细胞［3-6］。

1.2.3 红细胞裂解 两种方法获取骨髓细胞后，吸净上清后加入2 ml 红细胞裂解液，吹打混匀，室温2 min，PBS洗2遍，该骨髓细胞进行后续实验。

1.2.4 细胞活性测定 按上述方法得到小鼠骨髓细胞后，PBS洗2遍，调整细胞浓度为1×107个/ml，取100 μl 细胞悬液，加入0.5 μl Zombie AquaTMFixable Viability Kit，室温避光染色20 min，后使用含有5%FBS的PBS洗1遍，重悬于500 μl PBS中，BD AriaⅢ流式检测活细胞比例。

1.2.5 CCK-8 检测细胞增殖 按1.2.3 得到小鼠骨髓细胞后，调整细胞浓度为4×104个/ml，取100 μl细胞悬液接种于96 孔板，每组3 个复孔，分别于接种细胞后12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 各孔加入10 μl CCK-8溶液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中2 h，应用酶标仪检测450 nm波长处吸光度。

1.3 统计学处理 采用Graphpad 9.0 软件进行统计分析。数据均采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法获取小鼠骨髓细胞的时间 取同一只小鼠，随机选择左右下肢分别用两种方法处理。自小鼠麻醉开始至分离获得小鼠双下肢，嵌套EP 管法与注射器冲洗法步骤一致，所用时间一致。但自双下肢离体后至最终获得红细胞裂解前的小鼠骨髓细胞两种方法时间不同，嵌套EP管法所需时间更短（P<0.000 1），见表1。

表1 分离骨组织后至获得含红细胞骨髓细胞的时间Tab.1 Time between separation of bone tissue and acquisition of red blood cell-containing bone marrow cells

2.2 两种方法获取小鼠骨髓细胞的数量 EP管嵌套法暴露断端后所留骨组织长于注射器冲洗法，取得骨髓细胞后骨组织更为清亮（图2）。获取骨髓细胞红细胞裂解后进行计数，嵌套EP管法能获得更多骨髓细胞（P=0.003），见表2。

表2 获得的骨髓细胞数量（单侧下肢，1×107个/ml）Tab.2 Number of bone marrow cells（unilateral lower limb，1×107/ml）

图2 离心前后的骨组织Fig.2 Bone tissue before and after centrifugation

2.3 两种方法获取小鼠骨髓细胞的活细胞数量骨髓细胞进行红细胞裂解后使用流式方法检测活细胞比例，二者细胞分群一致，活细胞比例差异无统计学意义（P=0.619 5），见表3。

表3 获得的骨髓细胞的活细胞百分比（±s）Tab.3 Percentage of live cells in bone marrow cells （±s）

表3 获得的骨髓细胞的活细胞百分比（±s）Tab.3 Percentage of live cells in bone marrow cells （±s）

Note：Compared with tube-nesting EP method group，1）P=0.619 5.

Percentage of live cells/（%）97.80±0.57 97.60±0.651）Groups Tube-nesting EP method Traditional syringe irrigation method

2.4 两种方法获取小鼠骨髓细胞的细胞增殖能力 骨髓细胞进行红细胞裂解后培养，二者细胞增殖趋势相当（图3）。

3 讨论

为了研究骨骼和骨髓在生理和病理条件下的多种作用，研究人员必须采用一种简单有效的标准化方法来解剖小鼠长骨，以便进行大量的体内实验［1］。其中，小鼠骨髓细胞的提取是诸多科研实验的关键步骤。目前，国内外有关小鼠骨髓细胞的提取多为离心管冲洗法，PINEDA 等［8］利用两个不同大小的移液器枪头，去除尖端，嵌套后再次嵌套于1.5 ml EP 管中，利用离心的方法更快速获取更多的骨髓细胞。本研究的嵌套EP管法，在现有实验方法的基础上，改良了获取小鼠骨髓细胞的关键步骤，明显缩短了实验时间，并能够获得更多的有活性的小鼠骨髓细胞。

注射器冲洗法更依赖操作者的双手，如使用操作者的双手来固定骨组织及注射器，不仅操作时间更长，而且存在更多针刺伤的隐患，在增加医疗经济负担的同时，更易造成细胞的污染，而嵌套EP 管法获取小鼠骨髓细胞时，在分离小鼠获得双下肢后完全使用镊子等器械，更不易污染细胞且减少了针刺伤的风险，利于后续实验进行［7］。嵌套EP 管法中所使用的两种规格的EP 管均为一般实验室的常用设备，前期准备足够多的带洞的EP 管后可长期使用，简单易行。

重要的是，与离心管冲洗法相比，嵌套EP 管法显著提高了骨髓细胞获得率，而不影响细胞活力，非常适合骨髓细胞的原代和体外培养的研究，特别是那些需要高细胞数量的实验。HEIB 等［9］研究也使用类似的方法，但所用的离心机更大，离心时间为1 min，而本研究使用的桌面离心机更为便捷且所占空间更小，同时离心时间更短，进一步缩短了实验时间。

目前该嵌套EP管法适用于小鼠，因其体型的特点，其下肢骨可以置于500 μl EP 管内，暂不适用大鼠实验，大鼠的下肢骨较小鼠的长且更为坚实，且骨髓细胞含量丰富，使用传统注射器冲洗法亦简便可行。

综上所述，本研究的嵌套EP 管法，使用材料易于获取，操作简单可行，能够更快速获得更多的小鼠骨髓细胞，减少了实验成本与动物消耗，且减少了细胞污染及针刺伤的风险，适合推广使用。