MPN法检验大肠菌群的实验分析

苏章庭 曾晓琮 刘单单 杨丹婷 周露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

大肠菌群（coliform group、coliform）是指一群需氧及兼性厌氧、能在37℃培养24 h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性、无芽胞杆菌。它基本包括粪便内所有的兼性厌氧、革兰氏阴性的杆菌，典型的菌属包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠 杆 菌 属（Enterobacter）、克 雷 伯 氏 菌 属（Klebsiella）、哈夫尼菌属（Hafnia）等。但大肠菌群不是分类学上的命名，而仅作为一个工作定义[1-7]。

多管发酵法是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过系列稀释实验与结合概率理论，来估计水样中的总大肠茵群数。在一般的多管发酵实验中，样品需要先经过梯度系列稀释，再取一定体积的水样接种至液体培养基中，每个稀释度通常需要进行多组平行重复实验。然后根据培养过后的阳性管数，通过查阅MPN统计表估计实验结果[8-10]。

多管发酵法的结果以最可能数（Most Probable Number，MPN）来进行表示。实际上是根据统计学理论，估计水体中的大肠菌群密度的一种方法。如果从理论方面考虑，并且进行最大的重复实验，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向，但是只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少。所以对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显阴性的稀释度。因此，在实验设计时，水样检验所要求的平行实验数目，需根据所要求数据的准确度而定[11]。对于直接饮用的如矿泉水等预计不是严重污染的样品，可以采用单个稀释度作为预实验。对于稀释管中培养基的体积和平行数目应当根据水中预期的细菌密度和计划的稀释系列梯度而变化。

对于矿泉水水质中大肠菌群的检验，《GB 8538—2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》[12]采用5管法（使用5管10 mL乳糖胆盐培养基分别接种10mL水样）进行检验；世界卫生组织（Wrold Health Organization，WHO）《水质监测—淡水水质研究和监测计划的设计和实施实用指南》[13]中“第十章：微生物分析检测”采用6管法（使用1管50 mL乳糖胆盐培养基接种50 mL水样，5管10 mL乳糖胆盐培养基分别接种10 mL水样）。为了比较这2种方法的性能，本文采用不同的菌株，设计不同的浓度对这2种方法进行验证。

2 材料与方法

2.1 仪器、试剂与菌株

仪器：浊度仪（DensiCHEK plus，生物梅里埃中国）；MS3漩涡混合器（IKA仪器设备有限公司）；移液器（eppendorf中国）；Masticator均质器（IUL）；SX-700高压灭菌锅（日本TOMY公司）；PL6001E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Milli-Q Reference超纯水机（默克化工技术有限公司）。

试剂：PBS缓冲液、乳糖胆盐培养基、营养肉汤（均由北京陆桥技术有限责任公司生产）。

菌株：大肠埃希氏菌ATCC 25922，产气肠杆菌ATCC 13048，弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864，粪链球菌ATCC 29212。

2.2 方法

2.2.1 测试菌株与浓度选择

按照《GB 4789.28—2013食品安全国家标准食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[14]以及《SN/T 3266—2012食品微生物检验方法确认技术规范》[15]关于生长率、选择性和特异性的要求，选取了大肠埃希氏菌ATCC 25922、产气肠杆菌ATCC 13048、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864以及混合菌（大肠埃希氏菌ATCC 25922+产气肠杆菌ATCC 13048+弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864+粪链球菌ATCC 29212）进行实验。实验中使用的培养基为乳糖胆盐发酵培养液。

弗氏柠檬酸杆菌是柠檬酸杆菌属的模式种[16]。产气肠杆菌原本在肠杆菌属下，但是在最新的分类中已经划分到克雷伯菌属下[17]。两者均为大肠菌群中典型菌属的成员。大肠埃希氏菌、产气肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌在乳糖胆盐发酵培养液中的典型生长现象为产酸产气。混合菌液的主要作用是模拟竞争菌群，竞争菌群的存在使微生物检验更符合实际和更具挑战性。加入竞争菌群可使食品样品最接近于自然状态，其足以证实某类食品中目标微生物的部分回收率。

《SN/T 3266—2012食品微生物检验方法确认技术规范》中，关于人工污染的食品样品，要求有高、中、低3个接种水平（例如，102CFU/g～103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g）和一个未接种对照。对每个接种水平和阴性对照，都要用待确认方法和基准方法各检测5个样品。低接种水平应设定在接近检测限，中、高接种水平应当分别高1和2个对数级。如有必要，可加做中间水平以提高精密度。

将各个测试菌株分别接种到营养肉汤中，过夜培养。

2.2.2 混合菌液制作

混合菌液由大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和高一个浓度水平的粪链球菌组成，制作比例见表1。

表1 不同浓度实验的混合菌比例

2.2.3 梯度系列稀释

将经过培养的菌液稀释到0.58±0.02麦氏浊度，近似作为108浓度。在此基础上作梯度系列稀释，并制作100CFU/100mL，101CFU/100mL，102CFU/100 mL浓度的测试水样。

2.2.4 接种

将3个水平浓度的测试菌株水样分别进行6管法和5管法试验，同时设置阴性对照。

6管法：每个阳性污染浓度的水样取50 mL接种到盛有50 mL双料乳糖胆盐发酵培养液的100 mL试管，接种1份；再取10 mL接种到盛有10 mL双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5份。每个稀释度做7个平行。

MPN值按照世界卫生组织（Wrold Health Organization，WHO）《水质监测—淡水水质研究和监测计划的设计和实施实用指南》第十章：微生物分析检测中的MPN统计表进行验证。具体见表2。

表2 用1管50 mL和5管10 mL水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%可信限

5管法：每个阳性污染浓度的水样取10 mL接种到盛有10 mL双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5份。每个稀释度做7个平行。

MPN值按照《GB 8538—2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中55.1.2.5.1的MPN统计表进行验证。具体见表3。

表3 用5管10 mL水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%可信限

3 结果

3.1 高浓度实验

102CFU/100mL浓度的阳性菌（产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、混合菌）污染试验，6管法与5管法试验现象均为所有实验管产酸产气。符合大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气的生化特性。

3.2 中浓度实验

101CFU/100mL浓度的阳性菌（产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、混合菌）污染试验结果均大于0MPN/100mL。对于MPN值计算其标准偏差，结果没有明显差异。具体见表4。

表4 6管法与5管法的标准偏差

3.3 低浓度实验

100CFU/100mL浓度的阳性菌（产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、混合菌）污染试验，6管法与5管法试验结果存在不同。其中：

（1）产气肠杆菌污染试验6管法试验出现4次结果为＜1MPN/100 mL，5管法试验出现5次结果为0MPN/100 mL。

（2）大肠埃希氏菌污染试验6管法试验出现1次结果为＜1MPN/100 mL，5管法试验出现3次结果为0MPN/100 mL。

（3）弗氏柠檬酸杆菌污染试验6管法试验出现2次结果为＜1MPN/100 mL，5管法试验出现3次结果为0MPN/100 mL。

（4）混合菌污染试验6管法试验未出现结果为＜1MPN/100 mL，5管法试验出现3次结果为0MPN/100 mL。

本次试验具体结果见表5。

表5 多管稀释法实验结果

（续表5）

4 结论

实验结果表明，在高浓度水平下，所有实验管均能够表现出产酸产气的典型大肠菌群生化特性。在中浓度水平下，结合多个平行试验结果，5管法和6管法的数据离散程度未表现出较大差异。在低浓度试验中，6管法比5管法表现出了更高的灵敏度。

6管法加样量为100 mL，客观上更符合结果报告为“MPN/100 mL”。5管法加样量为50 mL，结果报告为“MPN/100 mL”，该种结果报告的单位是理论上的单位体积浓度而并不能体现实际检验的实验体积。所以，在客观上6管法采样体积更加符合MPN的结果描述。

根据参考的MPN表，将可以计算出置信区间的MPN值绘制出区间图。通过图1和图2的区间图的比较，6管法比5管法能够表现出更多的结果，即具有更好的精确度。从误差区间上看，6管法比5管法有更高的准确度。

图1 6管法部分MPN值区间图

图2 5管法部分MPN值区间图

5 讨论

5.1 多组MPN的平均值

对于多组发酵管的MPN平均值，应该根据各组发酵管的呈阳性反应管数的平均值来计算MPN值，不能直接取各组MPN值的平均数[18]。

对于中浓度计算MPN平均值。对于5管法，可以使用以下公式求解：

其中：n代表实验总试管数量；r代表培养后阳性试管数量；v代表接种体积；λ代表细菌密度。

对于6管法，设10 mL管的阳性管数量为r1，阴性管数量为r2，50 mL管的阳性管数量为r3，阴性管数量为r4。可得：

按最大似然方法求解MPN值[19-23]。

5.2 MPN的标准差与置信区间[24-26]

对于MPN的方差可以通过MPN计算公式的二阶微分方程求出：

其中：k表示稀释数；x表示阳性管数；d表示稀释因子；w表示接种量；λ表示细菌密度。

在以往的许多研究中，由于每管稀释液可能只含有少量样品。在这种情况下，MPN的分布会非常偏斜，而lgMPN的分布更接近对称。因此建议从lgMPN而非直接从MPN进行显著性检验和置信限的构造[27]。则有：

其中，6管法和5管法的MPN平均值与置信区间见表6和表7。

表6 6管法的MPN平均值与95%置信区间

表7 5管法的MPN平均值与95%置信区间

根据计算的MPN结果，将MPN值的置信区间绘制出区间图。从图3和图4误差区间上看，6管法比5管法有更高的准确度。

图3 6管法MPN平均值区间图

图4 5管法MPN平均值区间图

5.3 MPN的数值差异

判断MPN值之间差异的显著性，可以使用2个MPN值的合并标准差和t分布标准统计表来确定[28]。可得公式为：

计算6管法与5管法的SDlgMPN值与t检验统计量，结果见表8。

表8 6管法与5管法的SD lg MPN值与t检验统计量

自由度为f=5+6-2=9，查阅置信度a=95%的水平下的t检验分布表，结果表明无统计学意义。即6管法与5管法的MPN结果未表现出显著差异。可能原因是受实验样本数量、抽样量以及其他引起统计信噪比增大的因素的影响，需要进一步实验以提高实验精确度。