2021—2022年温州市细菌性食源性疾病暴发事件流行病学及病原学特征分析

章乐怡,楼辉煌,林谦阁,刘雪薇,李海燕,胡玉琴,洪程基,李 毅

食源性疾病是一个日益严重的公共卫生问题,造成了全球疾病负担和死亡率,美国食源性疾病每年给社会造成的负担约为 360 亿美元[1]。其中在细菌性食源性疾病中,沙门菌和副溶血性弧菌所致事件数及患病人数最多[2]。副溶血性弧菌在沿海省份引起的暴发比例最多,沙门菌在内陆省份引起的暴发比例最大[3]。2011—2020年浙江省细菌性食源性疾病暴发事件中病原菌以副溶血性弧菌居首位(58.41%),其次是沙门菌(18.38%)[4]。

本文采集2021—2022 年温州市细菌性食源性疾病暴发事件的监测数据,分析其流行病学特征和变化趋势,并对分离的病原菌进行血清学鉴定、PFGE分子分型、全基因组测序及药敏试验等,以了解本地区食源性疾病暴发病原菌的流行趋势、菌株的血清型别的变迁、分子分型特征及抗菌药物耐药性。

1 材料与方法

1.1 样品来源 样本来自2021年、2022年温州市19起细菌性食源性疾病暴发事件,在相关病人标本和食品、环境标本中分离出114株病原菌,包括副溶血性弧菌(55株)、弯曲菌(44株)、金黄色葡萄球菌(6株)、沙门菌 (6株)、致泻大肠埃希菌(3株),其中事件1-10病原菌为副溶血性弧菌,事件11-12病原菌为金黄色葡萄球菌,事件13病原菌为致泻大肠埃希菌,事件14病原菌为沙门菌,事件15-19病原菌为弯曲菌。

1.2 主要仪器和试剂 全自动微生物质谱鉴定系统MALDI Biotyper Smart(布鲁克北京科技有限公司);CHEF Mapper 型脉冲场凝胶电泳仪、Gel XR 型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);QuantStudio7FlexPCR仪(美国Thermo Fisher);弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒购自青岛中创汇科科技有限公司,革兰阴性需氧菌药敏检测板CHNM4F购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。所有试剂在有效期内使用。测序由苏州微次元生物科技有限公司完成。

1.3 实验室检测

1.3.1 病原菌分离鉴定 参照《浙江省食源性疾病监测工作手册》中的检测方法,对暴发事件中的相关标本进行副溶血性弧菌、弯曲菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、致泻性大肠埃希菌分离,用质谱方法、PCR方法、血清学分型等进行病原菌型别确定,用酶联免疫法进行金黄色葡萄球菌肠毒素测定。

1.3.2 菌株耐药性分析 沙门菌、副溶血性弧菌的药敏实验采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI) 推荐的微量肉汤稀释法。包含了9大类14种抗菌药物。将新鲜的菌培养物制成0.5麦氏浊度菌悬液,取10 μL加入到11 mL CAMHBT肉汤中,得到试验用菌悬液。用加样仪在药敏板中每孔加入50 μL菌悬液,36 ℃培养过夜后读取结果,记录MIC值。沙门菌、副溶血性弧菌耐药结果参照CLSI M45 2015(3th edition)、CLSI M100 2022(32th edition) 进行判读,大肠埃希菌(ATCC25922)作为质控菌株。

弯曲菌药敏实验根据CLSI推荐的弯曲菌琼脂稀释法。包含了7大类11种抗菌药物。空肠弯曲菌(ATCC33560)作为质控菌株。42 ℃微需氧培养48 h后读结果。记录弯曲菌对各类药物的最低抑菌浓度值(MIC值),根据美国NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)标准(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)及文献报道对弯曲菌的耐药进行判定[5]。

1.3.3 副溶血性弧菌、沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析 按照《2022 年国家食源性疾病监测工作手册》中食源性致病菌PFGE 操作程序制Plug,沙门菌、副溶血性弧菌分别以XbaI、NotI内切酶为限制性内切酶,沙门菌 H9812 作为分子质量标准。电泳条件设置参照手册进行。电泳后用 GelRed进行染色和纯水脱色,最后用凝胶成像仪成像,并使用Bionumerics 7.6生物信息学软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析。

1.3.4 全基因测序 利用全基因组测序对弯曲菌、金黄色葡萄球菌、致泻大肠埃希菌进行MLST分析,对分离的菌株进行基因组DNA提取后外送开展细菌全基因组测序。测序后获得的数据提交至pubMLST数据库,获取每个菌株7个管家基因的等位基因号,根据等位基因号确定ST型。并使用 BioNumeric软件对弯曲菌进行聚类,生成弯曲菌最小生成树。

2 结 果

2.1 流行病学结果 2021—2022年共发生19起细菌性食源性疾病聚集事件,包括10起副溶血性弧菌事件(发病200例)、5起弯曲菌事件(发病83例)、1起致泻性大肠埃希菌事件(发病7例)、2起金黄色葡萄球菌事件(发病20例)、1起沙门菌事件(发病11例)。事件发生时间分布在3至11 月,其中5月、7月、9月、11月均3起。暴发场所分别为酒店餐饮(10起)、学校(7起)、公司食堂(1起)和家庭(1起)。诱发因素分别为加工不当(10.53%,2/19)、生熟交叉污染 (42.11%,8/19)、原因不明9起(47.37%,9/19)。详见图1。

图1 2021—2022年食源性疾病暴发事件流行病学调查情况Fig.1 Epidemiological investigation of foodborne outbreaks from 2021 to 2022

2.2 实验室病原学检测结果

2.2.1 副溶血性弧菌血清型及PFGE分型结果 10起副溶血性弧菌事件中共分离到55株副溶血性弧菌菌株,包括47株病人株,8株食品及环境株。9起事件由副溶血性弧菌O10∶K4血清型引起的,仅1起事件由O3∶K6血清型引起。其中事件4中病人株以O10∶K4为主要血清型,但有一株病人株为O3∶K6血清型,事件 4、6、7、8、9、10分离的副溶血性弧菌均为O10∶K4血清型,且每起事件菌株间的 PFGE图谱一致,同源性高达 100%。事件 2、3、5中菌株PFGE图谱相似度分别为92.2%、96.9%、94.1%,同源性相对较高,条带数完全一致。事件1中3株菌的PFGE图谱相似度为100%,有一株菌相似度88.6%。事件3、6、9中有食品或物表涂抹物中分离出副溶血性弧菌,但血清型与病人株均不一致,均无法溯源到食品。47株病人株PFGE图谱见图2。

图2 47株副溶血性弧菌病人株PFGE聚类分析Fig.2 PFGE cluster analysis of 47 V. parahaemolyticus patient strains

2.2.2 弯曲菌MLST分型结果 5起弯曲菌事件共分离44株弯曲菌,经全基因组测序得到弯曲菌 MLST分型结果,44株弯曲菌分为7种ST型。其中事件17弯曲菌 ST型最为复杂,检出4种ST型,分别为ST2031、ST7533、ST11105、ST11106,刀具砧板表面、蒸柜容器把手表面均检出空肠弯曲菌(ST2031、ST11105),且分别有对应ST型的病人株检出。事件16、19病人株均为单一的ST型,分别为ST257、ST11711,而事件15(2021年)和事件18(2022 年)均为ST9079。见图3。

注:在最小生成树中,圆圈周围的数字代表弯曲菌MLST型别,圆圈的大小表示这个ST型的分离株数量。圆圈内不同颜色代表不同的事件。图3 44株弯曲菌分离株的最小生成树Fig.3 Minimum spanning tree of 44 Campylobacter isolates

2.2.3 金黄色葡萄球菌及其肠毒素结果 全基因组测序结果表明,事件11为家庭暴发事件,分离的金黄色葡萄球菌的ST型为ST188,其中病人、物体表面和食品株均为同一ST型,肠毒素结果为A型肠毒素;而事件12中出现18个病例,由于采样不及时,仅3个病例金黄色葡萄球菌分离成功,且分离出金黄色葡萄球的ST型均不同,分别为ST88、ST188、ST25,肠毒素结果均为A型肠毒素。

2.2.4 沙门菌血清型、PFGE分型及MLST分型结果 本研究中事件14的病原菌为肠炎沙门菌(9,12:m:-),6株分离株的MLST型别均为ST11,PFGE带型有2种,但这2种带型仅存在一条差异,根据Tenover原则[6-7],他们属于紧密相关,见图4。

图4 肠炎沙门菌PFGE分型结果Fig.4 PFGE cluster analysis of Salmonella Enteritidis

2.2.5 大肠埃希菌毒力基因及全基因组测序结果 事件15分离出3株肠聚集性大肠埃希菌 (EAEC),PCR毒力基因结果均为aggR、pic/astA阳性,MLST结果显示其中2株为ST156,另一株为ST4383。

2.2.6 药敏结果

2.2.6.1 44株弯曲菌分离株对11种抗菌药物的耐药结果 44株空肠弯曲菌分离株中,以四环素、萘啶酸、环丙沙星耐药率最高,分别达95.45%、90.91%、86.36%,其中5株弯曲菌出现多重耐药(11.36%,5/44)。除两起事件(事件15、16)分离的病人株之间耐药完全一致,其他事件分离的病人株之间耐药有差异。见表1。

表1 44株空肠弯曲菌分离株对11种抗菌药物的耐药率Tab.1 Drug resistance rate of 11 antimicrobial agents to 44 Campylobacter isolates

2.2.6.2 沙门菌、副溶血性弧菌对14种抗菌药物的耐药结果 6株肠炎沙门菌对青霉素类(氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦)、四环素、萘啶酸、多黏菌素E、头孢唑啉耐药,对其他几类抗菌药物敏感。55株副溶血性弧菌无多重耐菌株出现,其中50株副溶血性弧菌对头孢唑啉耐药,耐药率达90.91%,对碳青霉烯类等五大类抗菌药物均100%敏感。见表2。

表2 沙门菌和副溶血性弧菌分离株对14种抗菌药物的耐药率Tab.2 Drug resistance rate of 14 antimicrobial agents to V. parahaemolyticus and Salmonella isolates

3 讨 论

近年来我国平均每年发生食物中毒的人数接近 5 万人[8],2011—2020 年我国微生物食物中毒事件中主要的致病微生物为沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌[4]。本文通过对2021—2022年温州市细菌性食源性疾病暴发事件分析,显示本市副溶血性弧菌暴发事件占首位,这与本市地处华东沿海有一定关系。但本地区弯曲菌引起的食物中毒报告数呈上升趋势,已超过以往华东地区常见的沙门菌、金黄色葡萄球菌[9]。据美国的文献报道弯曲菌是最常见的食源性病原菌,每10万人中有19.5例感染[10]。而国内弯曲菌事件的低报告率事实上是由于检测手段的缺乏导致,这是一个被低估了的致病因素[11]。

据文献报道,84.91%细菌性食物中毒的暴发发生在5月至10月[2]。本研究中的副溶血性弧菌暴发事件符合细菌性食物中毒明显的季节性特征,大多发生在7月至10月,尤其在高温、高湿的夏季发生频率较高。而本研究中弯曲菌暴发事件则集中在4月、5月、11月,发生的季节气温相对比较低。在本市往年食源性疾病日常监测中也发现弯曲菌感染没有明显的季节性,一年四季中均有检出[11]。

19起细菌性食源性疾病事件的诱发因素分类情况分析表明有8起(42.11%)诱因是生熟交叉污染,而原因不明占了9起(47.37%)。在副溶血性弧菌暴发事件中,尽管3起事件的剩余食品(包括海产品及熟食)中均检出副溶血性弧菌,但经分子溯源后发现与病人株非同源,表明食品中污染的副溶血性弧菌型别非常多,没有检测到与病人株同型别的目标菌,由于发生的场所主要是酒店和学校食堂,菜品的复杂性、留样的规范性都是溯源不成功的因素。本研究中弯曲菌暴发事件全部发生在学校,其中一起弯曲菌事件在厨房的刀具砧板表面、蒸柜容器把手均分离到菌株,且与病人基因型一致。另一起发生在家庭的金黄色葡萄球菌事件中,在食物、物表和病人中检测到同一ST型的菌株。故生熟交叉还是厨房普遍存在的问题,原料间、原料与厨具间的污染均会造成暴发事件的发生。

本研究中10起副溶血性弧菌事件中有9起为O10∶K4血清型,只有一起事件为O3∶K6血清型。O3∶K6和O1∶KUT曾是与2008—2014年中国南方疫情相关的主要血清型[12],而近几年本市的食源性疾病监测数据表明,2019年开始出现O10∶K4,2020年逐渐变成优势血清型。2021年O10∶K4血清型占80.49%[13]。由于副溶血性弧菌基因重组频繁发生,如果重组发生在O和K抗原编码基因簇周围,血清型可能会发生改变[14],O10∶K4是由O3∶K6大流行克隆进化而来,它是血清变异之一[15]。密切关注副溶血性弧菌血清型的变异情况对本地区该菌在人群中的流行提供准确溯源依据。副溶血性弧菌耐药结果显示无多重耐菌株出现,90.91% 副溶血性弧菌对头孢唑啉耐药,与深圳报道的副溶血性弧菌事件中的耐药结果相似[16]。

在本研究中弯曲菌事件出现了7种ST型的弯曲菌,其中一起事件来源复杂,检出了4种ST型,其他均是由单一的ST型引起的。而2021年、2022年有两起事件均为ST9079,这些菌株在遗传关系上非常的接近,然而这个ST型在本市以往的散发病例监测中并没有发现,表明本市弯曲菌病人株存在遗传多态性。这些弯曲菌菌株对四环素、萘啶酸、环丙沙星耐药率较高,同时11.36%的菌株出现多重耐药现象。

国内沙门菌监测研究中显示[17],肠炎沙门菌在 2006、2012、2019年均占主导地位,该血清型在沙门菌引起的感染性腹泻中也属于优势血清型[18-19],在我国沙门菌暴发事件中则是出现频率很高的一种沙门菌[20]。由于沙门菌同一血清型内各菌株管家基因碱基序列的高度保守,绝大多数肠炎沙门菌ST型为ST11,本事件中6株肠炎沙门菌ST型均为ST11,但6株菌出现2种PFGE带型,这2种带型仅存在一个条带的差异,由于细菌的基因存在高度变异性,当有1～3条条带的差别时,则说明菌株间的亲缘关系较近。沙门菌耐药结果表明对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、萘啶酸、头孢唑啉等均耐药,与苏州报道基本一致。沙门菌的耐药日益严重,故需加强对沙门菌耐药性的主动监测,指导临床合理用药,降低抗菌药物耐药性的影响。

利益冲突：无