一种潜在结核病特异性诊断分子标志物Circ-IRAKM的筛选鉴定

马小燕,张 旭,马沁梅,宫照乾,于嘉霖,吴晓玲,邓光存

结核病(Tuberculosis,TB)是严重威胁全球公共卫生的流行病之一,它是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的慢性传染病[1]。据世界卫生组织(WHO)报告,2022年有近160万人死于结核病分枝杆菌感染,结核病的死亡率一直居高不下[2],研究表明,结核分枝杆菌感染宿主后,机体免疫机能良好时,其感染通常不会出现明显的临床特征,直到宿主免疫稳态被破坏,Mtb进入增殖期而诱发结核病[3]。由于结核病的发病机制复杂,早期症状不明显,发病进程受多种因素调节,导致感染初期的诊断和治疗面临挑战。因此,筛选早期诊断标志物和潜在的治疗靶点对结核病的防治具有重要的临床意义。

环状 RNA(Circular RNA,Circ-RNA)是一种不具有5′末端帽子结构和3′末端尾巴,呈闭环结构的非编码 RNA,能够稳定存在于生物体内[4]。近年来,随着高通量测序等技术的广泛运用[5-6],在多种人类疾病中都能够检测到Circ-RNA异常表达,其潜在功能受到广泛关注。研究发现,相较于健康人群,结核病患者外周血存在大量差异表达的Circ-RNA[7]。Circ-RNA可能通过细胞程序性死亡、炎性因子释放等生物学过程,参与结核病的发生发展[8]。但是,与结核病相关的大量Circ-RNA作为分子标志物的潜力和功能仍不清楚。

因此,研究拟基于数据库中结核病患者外周血差异环状RNA数据筛选获得Circ-RNA候选靶点,经GO/KEGG数据库预测候选靶点的生物学功能,通过qRT-PCR和琼脂糖凝胶电泳等方法进行验证,通过统计学进行临床相关性分析最终评价Circ-IRAKM作为活动性肺结核病患者外周血诊断分子标志物的潜力,为结核病患者早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本 分别收集宁夏回族自治区第四人民医院呼吸科诊断为活动性肺结核病患者的外周血,以及宁夏医科大学总医院门诊健康人群外周血。所收集外周血的患者性别不限、年龄大于14岁、均签署知情同意书。研究均获宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准(KYLL-2021-97)。共收集结核病患者标本105例,健康对照标本107例,通过筛选和排除标准,最终纳入结核病患者和健康对照各85例。

纳入标准:活动性结核病诊断参照中华医学会肺结核基层诊疗指南(2018)、肺结核诊断和治疗指南(2001)。纳入研究的患者符合以下条件:1)患者痰液中检出结核分枝杆菌或结核分枝杆菌体外培养为阳性;2)患者痰涂片为阴性,但影像学、临床症状及相关检查确诊该患者为肺结核患者;纳入研究的健康人群符合以下条件:经检查确认无结核相关临床症状,无结核病史的健康人,调查对象体检无异常表现,血液常规检测显示巨噬细胞、单核细胞、粒细胞等指标在正常范围内。

排除标准:1)患者患有免疫缺陷类疾病或者其它免疫系统疾病; 2)患者合并有肺癌慢性阻塞性肺病或其它肺部疾病; 3)受到乙型肝炎病毒或其它细菌、病毒感染的患者; 4)患者合并有其它部位的结核、合并心脏疾病或组织器官衰竭。5)调查对象为孕妇或者哺乳期妇女; 6)调查对象近期有手术史; 7)调查对象近期有服用免疫类药物、激素类药物的经历; 8)调查对象资料不全或拒绝参与调查研究。

1.2 结核病患者与健康对照间差异表达Circ-RNA筛选 通过NCBI-GEO(Gene Ession Omnibus)数据库检索获得结核分枝杆菌感染与健康对照之间差异表达Circ-RNA本底数据,重新进行分析。检索关键词为Circ-RNA,数据筛选方法为测序,所检测样品为2例结核病患者外周血及2例健康人外周血。本检索针对具有数据库公开的表达谱的原始数据或差异Circ-RNA筛选数据,采用的数据来源见表1。GSE103188为环状RNA芯片检测数据结果,样品为TB1,TB2,CON1,CON2,以TB vs CON差异Circ-RNAs的差异倍数(Fold change, FC)和显著性(P-value)为数据输入,设定筛选条件为: FC>4,P-value<0.01;400 bp

表1 筛选原始数据来源Tab.1 Source of Co-screened original Data

1.3 候选差异表达Circ-RNA的亲本基因预测及功能预测 通过CircRNADb和Circular RNA interactome数据库[10]检索候选Circ-RNA的开放阅读框(ORF)及RNA结合蛋白(RBP)种类和数量,通过MiRanda v3.3a预测候选Circ-RNA的miRNA靶点,通过StarBase预测miRNA的mRNA靶点。将与候选Circ-RNA相关的全部预测获得的mRNA为输入,通过DAVID数据库进行生物学功能预测,通过KEGG数据库进行相关信号通路聚类分析(GO/KEGG-信号通路聚类分析由北京博奥公司完成)。

1.4 qRT-PCR验证Circ-RNA在结核病患者外周血中的相对表达 纳入的85份结核病患者外周血样本均分为2管,一份通过反转录试剂盒(赛默飞,美国),进行总RNA提取并反转录成cDNA储存于-80 ℃备用。随后,另一份中随机选取5份结核病患者外周血样本,使用离心柱型全血基因组DNA提取试剂盒(百泰克,中国),提取全血基因组gDNA。分别以总RNA、cDNA、gDNA为模板,使用荧光定量PCR试剂盒(TAKARA,日本),以β-actin为内参进行验证。所需相关引物见表2。取qRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,收集qRT-PCR实验后的CT值,使用2-△△Ct方法分析qRT-PCR结果,计算相对表达量[11]。明确Circ-IRAKM环状序列引物扩增产物的特异性和保守性。

表2 实时荧光定量PCR所需引物Tab.2 Primer Required for qRT-PCR

1.5 统计分析 使用SPSS 23.0软件(IBM,美国)和GraphPad Prism version 8.0软件(Graphpad,美国)对数据进行统计分析。采用曲线回归分析及斯皮尔曼检验分析相关性,采用ROC曲线评价诊断价值,以曲线下面积(AUC)≥0.6表示具有诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 活动性结核病患者外周血差异表达Circ-RNAs的筛选 通过对GSE103188数据的重新分析,结果共发现147个差异显著的Circ-RNA(FC>4,P<0.05)(图1A),进一步严格筛选条件后,共发现32个差异显著的Circ-RNA(FC>4,P<0.01,400 bp

注:A为2例结核患者和2例健康对照外周血中差异表达Circ-RNA热图分析,筛选条件为FC≥4, P<0.05;B为提高筛选条件后差异表达Circ-RNA筛选结果热图分析,筛选条件为FC≥4, P<0.01, 400 bp

2.2 候选靶点Circ-RNAs的基因功能预测分析 候选Circ-RNA在结核病患者外周血中相对表达显著上调,其亲本基因功能相关性见表3。对Circ-RNA的亲本基因和RBP的功能预测,结果显示候选Circ-RNA的功能与先天免疫、细菌感染、炎性反应等相关(图2A,2B),提示其在先天免疫信号通路发挥重要调控作用。

注:A为GO分析预测5个候选Circ-RNAs的生物学功能;B为KEGG分析预测5个候选Circ-RNAs的功能相关的信号通路。图2 候选Circ-RNA信号通路预测分析Fig.2 Predictive analysis of candidate Circ-RNAs signaling pathways

注:A为5个候选Circ-RNA在健康人群外周血(1)、活动性结核患者(2)中相对表达(n=25);B为5个候选Circ-RNA在活动性结核患者外周血、健康人群PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。“ns”为P>0.05, “①”为P<0.05,“②”为P<0.01,“③”为P<0.001。M为标准蛋白分子量。图3 候选Circ-RNA的qRT-PCR验证Fig.3 qRT-PCR verification of candidate Circ-RNA

注:A为Circ-IRAKM 环状及线性引物设计位点;B为环状及线性引物分别在RNA、cDNA、gDNA中验证Circ-IRAKM;C为Circ-IRAKM 在60例活动性结核患者与健康人群外周血中的相对表达;D为外周血中Circ-IRAKM的诊断活动性结核的ROC曲线分析;“①”为P<0.05,“②”为P<0.01,“③”为P<0.001。M为标准蛋白分子量。图4 Circ-IRAKM在活动性结核患者外周血中的表达验证Fig.4 Validation of Circ-IRAKM in peripheral blood of active TB patients

表3 候选Circ-RNA 的基本信息Tab.3 Basic Information of Candidate Circ-RNA

随机选取经排除标准后纳入的85份活动性结核病患者外周血样本中的25例提取RNA,通过qRT-PCR与琼脂糖电泳实验验证备选Circ-RNA的表达情况,结果显示Circ-IRAKM在结核病患者外周血中表达显著上调且条带清晰均一(图3A、3B),提示Circ-IRAKM可作为分子标志物检测靶点。

2.3 Circ-IRAKM在活动性结核病患者外周血中的表达 Circ-IRAKM序列与亲本基因几乎一致,仅有反向剪切位点是保守的。因此,评价其诊断价值前,需要对其引物进行验证。特异性验证结果显示,仅有反向剪切位点的引物在转录水平能够扩增出环状序列产物(图4A、4B)。提示设计的特异性引物能够在外周血核酸中扩增出Circ-IRAKM。

qRT-PCR验证60例活动性结核病患者与60例健康人群外周血中Circ-IRAKM的相对表达,结果显示Circ-IRAKM在活动性结核病患者外周血中表达极显著上调(图4C)。ROC曲线分析结果显示Circ-IRAKM用于鉴别健康人群和肺结核病患者的特异性为0.995,灵敏度为0.937(图4D)。结果提示Circ-IRAKM能够区分出结核病患者。

2.4 Circ-IRAKM的功能预测及与活动性结核病的相关性分析 通过CircRNADb数据库发现Circ-IRAKM源自亲本基因IRAK3第2-5号外显子的反向剪切,其结构上具有miRNA结合位点(图5A),提示其可能通过miRNA吸附作用发挥调控作用。以Circ-IRAKM亲本基因、miRNA靶点为关键词输入,经GO/KEGG分析表明其可能通过NF-κB信号通路、炎性反应、释放细胞因子参与病原-宿主博弈过程(图5B,5C)。由此提示,Circ-IRAKM不仅可作为活动性结核病患者诊断的潜在靶点,而且可能在结核病的发生发展中发挥重要作用。

注:A为Circ-IRAKM靶基因miRNA的预测(仅显示已报到与结核病相关的miRNA);B为Circ-IRAKM 靶基因miRNA的生物学功能预测;C为Circ-IRAKM 靶基因miRNA的信号通路预测。图5 Circ-IRAKM的功能预测及与活动性结核的相关性分析Fig.5 Functional prediction of Circ-IRAKM and correlation analysis between Circ-IRAKM and active TB patients

注:A为曲线回归分析活动性结核患者外周血中Circ-IRAKM的相对表达与单核细胞相关性;B为曲线回归分析活动性结核患者外周血中Circ-IRAKM的相对表达与巨噬细胞相关性;“①”为P<0.05,“②”为P<0.01,“③”为P<0.001。图6 Circ-IRAKM与活动性结核患者免疫细胞募集相关性分析Fig.6 Correlation analysis between Circ-IRAKM and recruitment of immune cells in active TB patients

2.5 Circ-IRAKM表达与活动性结核病患者免疫细胞募集相关性分析 收集60例活动性结核病患者的血常规检查结果,通过斯皮尔曼双变量相关性分析及曲线估算分析Circ-IRAKM的临床相关性见表4。结果显示,Circ-IRAKM相对表达与单核细胞相对值(单核细胞相对值40%～75%)、绝对值(单核细胞绝对值1.80～6.30,109/L)相关性无统计学意义,与巨噬细胞相对值(巨噬细胞相对值3.0%～10.0%)、绝对值(巨噬细胞绝对值0.1%～0.6%)呈显著正相关(△CT值与表达水平相反)(图6A、6B)。结果进一步提示Circ-IRAKM能够在结核病早期诊断中发挥重要作用,其可能参与结核病分枝杆菌与宿主巨噬细胞的相互作用和免疫反应。

表4 斯皮尔曼双变量分析外周血中Circ-IRAKM的相对表达与患者血常规指标的相关性Tab.4 Spearman bivariate analysis of the relative expression of Circ-IRAKM in peripheral blood and the correlation between patients’ blood routine indexes

3 讨 论

结核分枝杆菌可通过呼吸道进行人与人之间传播,如果感染了结核分枝杆菌,不到10%的感染者会出现结核病的临床症状,而大多数人会发展为潜伏性结核病感染。因此,早期诊断对结核病的及时防治至关重要[12]。传统的结核病诊断标志物及方法在诊断过程中具有耗时长,仪器昂贵,检测流程复杂等缺陷[13-14]。因此从宿主本身寻求特异性诊断标志物具有重要意义。Circ-RNA是一种有别于传统线性RNA的非编码RNA,其特殊的共价闭环结构决定其能够通过多种机制发挥功能[15],作为临床检测诊断与预后的标志物更具前景。然而能作为结核病诊断标志物的Circ-RNA与筛选到差异表达的Circ-RNA相比寥寥可数[16-18]。因此,探究Circ-RNA在结核病发病机制中的潜在作用,可为结核病的临床治疗提供更多可能性。

本研究发现Circ-IRAKM在活动性结核病患者外周血中显著上调,ROC曲线分析结果证明其足以区分健康人群与结核病患者。Circ-IRAKM的结构与其亲本基因的相关性较强[19]。其亲本基因白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)家族有4个成员组成分别为IRAK1、IRAK2、IRAKM、IRAK4,能够介导来自TLR和白细胞介素-1受体的激活信号[20]。IRAKM是一种具有596个氨基酸,分子量为68 kDa的蛋白质分子。IRAKM能够通过阻止IRAK1,IRAK4与MyD88的解离以及IRAK1-TRAF6复合物的形成来进行负调控作用,IRAKM的C端结构域与TRAF6的相互作用至关重要,其具有1个TRAF6相互作用基序[21]。因此推测,Circ-IRAKM可能通过炎性反应在结核病发病机制中发挥调控作用。

环状RNA上富含miRNA分子结合位点[22]。在Circ-IRAKM的靶基因miRNA预测中我们发现Hsa-miR-488、Hsa-miR-7、Hsa-miR-16-3p、Hsa-miR-146a-3p、Hsa-miR-146b-3p、Hsa-miR-27-5p都与结核病发病相关,其很有可能通过亲本基因进行miRNA吸附作用发挥调控功能。对以上靶点基因进行GO/KEGG分析,发现其通过NF-κB等炎症反应参与病原与宿主相互作用的关联性较强[23],其中Hsa-miR-7被发现与TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-8和IL-10的细胞因子水平之间存在显著相关性。但其具体调控机制尚不清楚[24]。这为Circ-IRAKM可能通过这些miRNA靶点参与结核病分枝杆菌感染后机体免疫应答过程提供了依据。

与普遍表达的IRAK1、IRAK2、IRAK4相比,IRAKM的表达仅存在于单核细胞与巨噬细胞[25],我们的研究进一步表明结核病患者外周血中Circ-IRAKM的表达水平与巨噬细胞的数量呈显著正相关,推测Circ-IRAKM会促进感染部位巨噬细胞的大量募集。巨噬细胞作为抵御早期感染关键的免疫应答的细胞,能够根据感染微环境的变化做出相应的免疫反应。也就是说,结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活决定了感染的结果和结核病的进展[26]。据文献报道,干扰IRAKM会导致结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的细菌载量降低,同时可诱导巨噬细胞M1型极化,抑制M2型极化[27]。因此,Circ-IRAKM不仅能够为结核病早期诊断提供更多线索而且其在结核病发病机制中的作用也值得进一步研究。

然而,目前我们的研究仅在结核病患者的外周血中验证了Circ-IRAKM,而在其他疾病样本中未进行检测,还不能说明其可独立用于检测结核病患者。因此,后续我们会收集其他疾病样本进行检测比对,进一步验证Circ-IRAKM作为结核病早期诊断标志物的特异性。

利益冲突：无