2010—2019年咸阳市食品及芝麻酱加工环节中单增李斯特菌污染状况及其分子流行病学特征分析

张俊君,王莹莹,杨 囡,王丽娟,刘 刚,秦 龙

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种重要的食源性人兽共患病原菌,在自然界普遍存在,且不易被冻融、强烈光照等因素杀死,抗热能力强,可在范围较广的pH条件下生长,具有嗜冷性,能在4 ℃的温度下存活和繁殖,形成生物膜可长期在食品生产加工企业存活,是威胁冷藏食品安全的主要病原菌之一[1]。近年来由单增李斯特菌引起的食物中毒事件在国内外常有发生,主要是通过食用被污染的食物进行传播[2-3],易感人群包括老人、新生儿、孕妇和免疫缺陷人群,可导致发热性胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产、新生儿感染等,病死率较高[4-5]。许多国家将单增李斯特菌列为进出口食品的必检项目[6],我国于2001年建立了全国食源性致病菌监测网,在全国范围内开展不同种类食品中单增李斯特菌污染状况监测。

本研究对咸阳市2010—2019年12类食品及芝麻酱加工环节中的单增李斯特菌进行分离鉴定、血清学分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、全基因组测序(Whole Genome Sequencing,WGS),并进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),核心基因组多位点序列分型(core genomeMLST,cgMLST),以了解咸阳市食品中单增李斯特菌的污染情况,初步建立咸阳市单增李斯特菌PFGE指纹图谱库,掌握单增李斯特菌的分子流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 样品来源 按照国家食品安全风险监测工作手册[7],于2010—2019年采集了咸阳市区及其管辖县(礼泉县、长武县、彬县、三原县、泾阳县、淳化县)的超市、农贸市场、街边小摊和芝麻酱加工过程等样本,10年共采集12类1 699份样本,主要包括生肉制品、熟肉制品、水产品、速冻米面制品、即食非发酵性豆制品、糕点及饼干、中式凉拌菜、冷冻饮品(冰激凌)、陕西特色食品、外卖、水果/水果干、芝麻酱加工过程样本,进行单增李斯特菌检测。

1.2 培养基、试剂及设备 木糖、鼠李糖和PALCAM琼脂购自北京路桥公司,LB增菌液购自广东环凯公司,血平板和单增李斯特菌显色平板购自青岛海博公司,API20E生化鉴定条和革兰阳性菌鉴定卡购自法国梅里埃公司,单增李斯特菌分型血清购自日本生研株式会社,限制性内切酶XbaI和AscI购自美国NEB公司,全基因组DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司,微生物质谱购仪购自青岛融智生物公司,脉冲场电泳系统购自美国伯乐公司。

1.3 菌株分离和培养 依据《国家食品安全风险监测工作手册》和GB4789.30-2010《单核细胞增生李斯特氏菌检验》,进行预增菌、二次增菌、选择性培养,再通过生化反应和微生物质谱进行鉴定。

1.4 血清学分型 单增李斯特菌血清凝集O抗原和H抗原实验参照日本生研血清试剂的使用说明操作。

1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 参照中国CDCPulseNet标准操作规程,进行胶块的制备、裂解、洗涤,用内切酶AscI进行酶切,电泳图谱用BioNumerics7.6进行标记和分析,用UPGMA聚类方法建立系统发生树,以相似系数100%确定为同一带型,参照PulseNet的PFGE条带命名原则对带型进行命名。

1.6 全基因组测序 分离鉴定得到单增李斯特菌,使用全基因组DNA提取试剂盒提取DNA,送至上海伯杰医疗科技股份有限公司进行全基因组测序,测序策略为全基因组鸟枪法,将质控检测合格的DNA打断,构建不同插入片段的文库,用Illumina NovaSeq对文库进行双末端测序,使用BioNumerics7.6软件对测序原始序列进行拼接和分析。

1.7 菌株谱系、血清型和MLST分析 利用法国巴斯德研究所的单增李斯特菌数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)分析72株菌全基因组序列,得到菌株谱系、序列型(ST)和克隆群(clonal complex,CC)信息。基于基因序列分成5个血清群(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅳa和Ⅳb)[8]。按照MLST的7个管家基因中只有1个位点不同定义为同一个CC型,使用BioNumerics7.6软件构建谱系和CC型生成树。

1.8 核心基因组多位点序列分型(core geno-meMLST,cgMLST) cgMLST的进化树构建通过BioNumerics 7.6软件完成。cgMLST分析框架采用法国巴斯德研究所报道的方法,包括单增李斯特菌EGD-e参考菌株上1 748个高度保守的核心基因[9],根据cgMLST中等位基因差异数≤150个,定义为一个亚群(sublineage,SL),亚群中等位基因差异数≤10个视为同源,11～24个视为可能相关,>25个视为非同源[9-10]。BioNumerics 7.6采用Complete linkage方法,比例因子Scaling factor设为1[9],等位基因差异数≤10个认为是同源菌株。

1.9 抗性相关基因分析 使用本地BLASTN软件,将李斯特菌基因组岛LGI1(CP001602)、LGI2(NZ_CM001159)分别与72株菌基因组进行比对,参数设置中基因覆盖度及一致性阈值均为大于85%。

1.10 质量控制 使用中国CDC食品与营养安全所下发的单增李斯特菌参考菌株(CMCC54004)做为质控菌株。

1.11 统计学分析 利用Excel完成数据整理,使用SPSS19.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 单增李斯特菌检出情况 2010—2019年共采集1 699份样品,检出单增李斯特菌72株,总检出率4.24%。不同种类食品中,有8类食品检出单增李斯特菌,生肉制品检出率最高(18.49%),其次为水产品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)、中式凉拌菜(5.31%)、速冻米面制品(4.84%)、陕西特色食品(2.58%)、芝麻酱加工过程样品(2.31%)、外卖(1.43%)。有4类监测食品中未检出单增李斯特菌。不同种类食品中单增李斯特菌检出率差异具有统计学意义(P<0.001)(表1)。

表1 2010—2019年咸阳市不同食物种类中单增李斯特菌检出情况Tab.1 Detection of L. monocytogenes in different foods in Xianyang from 2010 to 2019

2.2 血清型鉴定结果 72株分离株分为5种血清型:1/2a(31/72,43.06%)、1/2b(22/72,30.56%)、1/2c(10/72,13.89%)、4b(6/72,8.33%)、4a(3/72,4.17%)。1/2a、1/2b和1/2c为咸阳市市售食品中单增李斯特菌的主要血清型(图1)。

2.3 PFGE分型结果 72株单增李斯特菌基因组DNA采用AscI酶切后,产生8～12个条带,分子量大小在20～1 000 kb。经BioNumerics 7.6软件分析,共获得40种PFGE图谱类型(GX6A16.XY0001-GX6A16.XY0040,后文简写为XY0001-XY0040),相似度在25.5%～100%。XY0009型(16/72,22.22%)、XY0004型(8/72,11.11%)和XY0003型(5/72,6.94%)为主要的图谱类型。不同种类的食品中可以检出相同的带型(表2)。本研究选取了一家具有代表意义的酱制品加工厂,原料为芝麻,对企业从原料、加工中间产品、终产品、环境、仪器设备等全过程进行采样分离,XY0009型中有14株分离株来自该芝麻酱生产企业,并且分离自多个生产环节(图1,表3)。

表2 各类食品中PFGE图谱分布Tab.2 Distribution of PFGE types among various food types

表3 某企业生产环节单增李斯特菌检出情况Tab.3 Detection of L. monocytogenes in the production process of an enterprise

2.5 谱系、血清型、序列型和CC型分型结果 72株单增李斯特菌菌株分为3个谱系,其中谱系Ⅱ为优势谱系(56.94%,41/72),以Ⅱa为优势血清型(43.06%,31/72),分属16种序列型和15种CC型(表4),优势序列型为ST224、ST8、ST9、ST87,其中ST224全部分离自某芝麻酱生产企业生产过程,ST8、ST9、ST87主要分离自生肉制品、中式凉拌菜和速冻米面制品,且在不同年份均有检出。抗性基因分析未发现株菌携带抗季胺盐类消毒剂基因组岛LGI1,有6株来自水产品和生肉制品中的CC2型菌(8.33%,6/72)携带LGI2(抗镉基因cadA和cadC以及抗砷基因arsD2、arsA1、arsR1、arsD2、arsR2、arsA2、arsB1、arsB2)。

表4 72株单增李斯特菌谱系、血清和CC型构成情况Tab.4 Lineages, serotypes, and CC types of 72 L. monocytogenes strains

2.6 cgMLST分型结果 谱系Ⅰ菌中1 748个等位基因差异数最大为1 250,谱系Ⅱ型为1 410,谱系Ⅲ为1 600。通过cgMLST分析,共分为19个亚群(sublineage,SL),与CC型(15个)基本一致(图2)。按照cgMLST等位基因差异数≤10个认定为同源性的标准,27株SL004、SL006和SL007菌株共有6组同源菌株(图3)。

注:分支上的数值为等位基因差异数。图2 72株单增李斯特菌cgMLST聚类图Fig.2 cgMLST dendrogram of 72 L.monocygenes strains

注:SL004:11株CC8,SL006:9株CC9,SL007:7株CC87,分支上的数值为等位基因差异数。图3 27株亚群SL004、SL006和SL007单增李斯特菌cgMLST聚类图Fig.3 cgMLST dendrogram of 27 L. monocytogenes strains belonging to sublineages 004, 006, and 007

3 讨 论

近年来,食源性致病菌污染所导致的食品卫生安全事件受到社会各界的广泛关注,由食源性致病菌引起的食源性疾病已经成为一个世界性公共卫生问题。我国自2009年开始建立全国食源性致病菌监测网络,目前已经建立起覆盖各省、市、县并逐步延伸到农村地区的监测体系,通过及时、准确的检测为食源性疾病的暴发提供预警,为制定有效的防控措施提供依据。咸阳市于2010年加入全国监测网络,2013年和2014年已有相关调查报道[11-12]。

本研究对2010—2019年咸阳市12类食品和芝麻酱加工过程中单增李斯特菌进行了监测,在8类食品中检出单增李斯特菌,总检出率4.24%,总检出率低于绵阳市(9.7%)[3],高于渭南市(2.98%)[13]和河北省(1.34%)[14],与北京市顺义区(4.28%)[15]接近。不同食品种类中单增李斯特菌检出率差异具有统计学意义,生肉制品检出率最高(18.49%),其次为水产品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)和中式凉拌菜(5.31%),与北京市[16]、吉林省[17]报道结果一致,符合Meta分析研究中我国东北和中部地区肉制品检出率高的结论[18]。

在检出率较高的这4类食品中,生肉制品在复杂的屠宰、加工、流通、运输过程易受到单增李斯特菌的污染。水产品在加工过程反复与案板、刀具、容器接触也易受污染。熟肉制品在加工过程中如果没有充分烧熟煮透,就可能使存在于生肉中的单增李斯特菌存活繁殖,而且制作好的熟肉制品若未有效冷藏、与其他生肉共同存储也会导致被单增李斯特菌污染;中式凉拌菜多采用冷加工方式制作,可能在加工过程中受到单增李斯特菌污染,且食用前不再加热直接入口。应加强宣传教育,提高居民个人食品安全意识,生熟案板分开,避免直接食用生肉制品及生食水产品。同时加强对这几类食品在加工、储存、运输和销售环节的卫生监督,防止由单增李斯特菌引起食源性疾病的发生。

根据菌体O抗原和鞭毛H抗原,可将单增李斯特菌分为13个血清型,对人致病的主要血清型为4b,其次是1/2a和1/2b,三者约占本病的90%[19]。本研究分离的72株单增李斯特菌有5种血清型,优势型为1/2a、1/2b和1/2c,与我国食品中单增李斯特菌最常见的血清型相一致[20]。72株分离株分为40种PFGE图谱类型,初步建立了咸阳市单增李斯特菌PFGE指纹图谱库,可为单增李斯特菌引起食品污染监测提供预警及食源性疾病病原学分析和溯源提供参考数据。

单增李斯特菌主要分为4个谱系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),病人来源的分离株主要属于谱系Ⅰ[8,21],ST87、ST3和ST7是其主要ST型;谱系Ⅱ菌株主要分离自食品,最常见的序列型为ST9、ST8、ST87[22]。本研究中72株单增李斯特菌分离株全部来自食品,谱系、血清群、ST型和CC型多样化,以谱系Ⅱ和血清型Ⅱa为主,分属15个CC型和16个序列型,其中优势序列型ST8、ST9、ST87在不同年份的生肉制品、中式凉拌菜和速冻米面制品中检出率较高,特别是ST87常在临床中检出,故对于检出ST87的食品应进行重点监测。

本研究分离到6株(8.33%)4b血清型单增李斯特菌,全部来自于水产品和生肉制品,均为CC2型,抗性基因分析均携带有LGI2,LGI2存在于CC2型菌株,特别是4b血清型菌株中,有助于提高菌株的毒力[23-24],故应对此污染现象加以重视。另外结合PFGE分型结果可以看出,9型图谱中15株1/2b血清型菌株的PFGE带型聚类效果好,相似度100%,而1/2a和1/2c血清型菌株的PFGE型别较分散,菌株同源性差,相比较血清分型,PFGE分型效果更好。另外分析本研究中菌株来源、分离时间与PFGE的关系发现,XY0003、XY00034、XY00035型图谱中,不同来源、不同年份分离到的菌株也出现相同的PFGE图谱类型,提示咸阳市不同市售食品之间可能存在相同的污染来源,或者存在交叉污染的可能性,并且污染源持续存在。另一方面,不同时间采集的同一类来源食品中可以分离到不同PFGE图谱类型的菌株,如生肉制品中22株菌,分属15个PFGE图谱类型,表明这些来源的单增李斯特菌的持续污染来自于不同的克隆株,需要引起食品卫生部门的重视。

2018-2019在某芝麻酱生产企业专项监测中检测到单增李斯特菌污染,首次检测,在前处理区、灌装区和整箱包装区的原料、环境、仪器设备、中间产品和终产品中检出12株单增李斯特菌,灌装区分离株占66.67%,PFGE分型图谱类型一致,提示该企业整个生产环节存在单增李斯特菌交叉污染,灌装区受污染情况最为严重。首次检测结果反馈后该企业实施了整改措施,启动清洗消毒程序,并对原料进行了熟制处理。10个月后进行第2次采样,自原料中检出2株单增李斯特菌,生产环节未检出,企业采取的措施有效控制了污染,分析该企业的可疑污染源主要为原料与后续加工环节的交叉污染,也提示该企业要加强生产原料的质量控制。第2次分离的2株菌与首次分离的12株菌PFGE分型为同一图谱类型,疑为同一个污染菌株的持续污染,经cgMLST分型,14株菌均为ST224型,13株菌属同一个亚群,首次分离的1株菌为另一亚群,等位基因差异数较大,推断该企业首次采样时生产环境中可能存在2个克隆株污染,同时显示相对于PFGE方法,cgMLST方法的分辨率更高,分型效果更好。单增李斯特菌作为食品加工环境常驻菌,与其携带应激生存岛和其他环境抗性基因有关[25-27],结合水产品和生肉制品中单增李斯特菌携带LGI2的情况,下一步搜集临床病例及分离菌株,从毒力基因和抗性基因水平研究其致病性。

本研究中ST224型为优势序列型,这与芝麻酱企业生产过程交叉污染导致该型单增李斯特菌高检出率有关,16株ST224型分离株中有2株分离自其他食品,而在本地还未有食品中ST224型菌株检出的报道,推断该企业的原料在市场流通环节与污染ST224型菌株的食品存在持续交叉污染。

全基因组测序技术分辨率力强,已成为流行病学调查和分子溯源的重要工具。PFGE分型技术重复性好,并且已经标准化,是近几年国家食品安全风险监测和食源性疾病监测中要求的一项溯源技术。本研究中PFGE和cgMLST分型结果为72株分离株分属40个带型和19个亚群,PFGE有较高的分辨率,但按照菌株等位基因差异数≤10的同源性判定标准,27株SL004、SL006和SL007优势菌株识别出6组同源菌株,这6组同源菌株的PFGE带型均不相同,相对于PFGE方法,cgMLST技术分型能力更强,可做为食源性疾病暴发调查的主要手段[28]。

通过本次研究,了解了咸阳市食品污染单增李斯特菌的基本状况、风险较高的食品种类、优势菌型以及遗传进化特征,对于今后的监测重点以及下一步的研究指明了方向。在同源性菌株识别方面,cgMLST分型优势明显,尤其为某企业寻找单增李斯特菌的污染来源提供了准确依据。今后的监测工作以及食源性疾病事件调查中,将结合PFGE和全基因组测序分析,重点依靠cgMLST分型对可能出现的食源性疾病事件进行预警,为食源性疾病暴发后的识别、溯源和调查提供技术支持。

利益冲突：无