珍珠岩细菌内毒素干扰试验研究

何映霞，蔡春杨，张宝献，郭心怡，滕世超，孟丽丽，陈虹

（华兰生物工程重庆有限公司，重庆 408100）

血浆蛋白制品的纯化制备过程中会应用到压滤技术，该技术能对血浆蛋白沉淀和其上清液进行有效分离[1]。纯化处理后的珍珠岩适合分离颗粒较大的混悬液，可过滤血浆、血清、血液蛋白等[2]，在血液制品生产中常作为助滤剂去除有害的活性成分。细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖，为外源性致热源，可激活中性粒细胞等释放出内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。珍珠岩中细菌内毒素限度检查可采用限度法[3]，在生产中常用鲎试剂检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可与细菌内毒素发生凝集反应[4]。除了细菌内毒素，鲎试剂还可与某些β-葡聚糖反应，产生假阳性结果，致使将符合使用要求的珍珠岩误判为细菌内毒素不符合限度规定。如遇含有β-葡聚糖的样品，可使用去G 因子鲎试剂或G 因子反应抑制剂来排除鲎试剂与β-葡聚糖的反应。

试验中，用于溶液配制或样品有直接接触的容器须将外源性细菌内毒素灭活。玻璃器皿常用干热灭菌法（250 ℃灭菌30 min 以上）或其他不影响细菌内毒素检查内毒素灭活方法。若使用与溶液或样品有直接接触的塑料器具应选用经生产厂家证明无内毒素并且对试验无影响的塑料器具[5]。本文通过研究珍珠岩细菌内毒素检查溶液的制备方式，确认该物料能采用鲎试剂（凝胶法）对该物料进行细菌内毒素检查，为该物料的细菌内毒素检查溶液制备提供操作依据。

1 试剂、材料及仪器

1.1 试剂

细菌内毒素工作标准品，批号为1806131，规格为10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司，2 ～8 ℃保存；鲎试剂，批号为1812263、1902272、1903131，规格为0.06 EU/mL、0.1 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，2 ～8 ℃保存；细菌内毒素检查用水，批号为1807310、1902260，规格为5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，室温保存；稀释剂Ⅱ，批号为1804260，规格为4 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，室温保存；铬酸洗液，自配，室温保存；珍珠岩，批号为H2P1810、H2P18296，美国Harborlite 公司。

1.2 材料与仪器

旋涡混匀器、移液器（100 ～1 000 μL）、移液器（20 ～200 μL）、无内毒素吸头、无内毒素离心管（50 mL）、玻璃试管（15 mm×100 mm）、16 mm 离心管架、密封膜、石英钟、砂轮。

2 方法与结果

2.1 试验准备

2.1.1 玻璃器皿清洗

将铬酸洗液倒入与溶液或样品有直接接触的玻璃器皿中浸泡1 h，将器皿中的铬酸洗液倒入回收瓶，用自来水洗净玻璃器皿中残留的铬酸洗液，再用纯水反复冲洗3 次以上，洗干净的玻璃试管放入试管架上沥干水分，用锡箔纸包好，备用。

2.1.2 去除玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素

将用锡箔纸包好的玻璃器皿，放入经验证过的电热恒温鼓风干燥箱中，将温度调至220 ℃，待设备升温至预设温度后计时，恒温保持180 min 以上，关掉电源，降温，取出待用。

2.2 鲎试剂灵敏度复核操作步骤

2.2.1 细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素工作标准品1 支，用BET 水（细菌内毒素检查用水）1.0 mL 溶解，旋涡混匀15 min，然后BET 水将工作标准品稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度）。

配制4 管细菌内毒素标准溶液，内毒素单位分别为0.125 EU/mL、0.06 EU/mL、0.03 EU/mL 和0.015 EU/mL。

2.2.2 待复核鲎试剂的准备

取18 支鲎试剂。每支均用0.1 mLBET 水复溶，备用。

2.2.3 加样

2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液每一浓度加4 支管，加样体积为0.1 mL，另取2 支管加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，加样体积均为0.1 mL，作为鲎试剂复核用。干扰试验加样方式见表1。

表1 鲎试剂标识灵敏度对照系列溶液加样方式

2.2.4 保温

加样结束后，用密封膜将鲎试剂管口密封，混匀时避免气泡产生，垂直放入（37±1）℃电热恒温水浴箱中，保温（60±2）min。

2.2.5 观察并记录结果

将鲎试剂管从电热恒温水浴箱中轻轻取出，倒转180°且动作须轻缓，若管内形成的凝胶不变形、滑脱者为阳性，记录（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形、滑脱者为阴性，记录（-）。

2.2.6 试验结果计算

当最大浓度2λ的4 管均为阳性，最低浓度0.25λ的4 管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按式（1）计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。式中：n为平行管数（等于4），X为每列阳性结果所对应的最小内毒素浓度的对数值（lg）。

2.2.7 结果

3 批鲎试剂的灵敏度为0.06 EU/mL，与标示灵敏度一致。

2.3 初筛预实验

由于干扰实验检验在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应，珍珠岩pH 值在5 ～11，而细菌内毒素实验在中性，所以需要选择稀释剂进行中和，根据湛江安度斯稀释剂Ⅰ和稀释剂Ⅱ的用途，选择适宜的稀释剂Ⅱ作为珍珠岩细菌内毒素检查溶液的酸碱度调节剂。

2.3.1 珍珠岩细菌内毒素检查溶液的获取

取珍珠岩适量（按照珍珠岩细菌内毒素限度为不大于1 EU/g 取样），用细菌内毒素检查用水溶解稀释至2 倍最大有效稀释倍数（Maximum Valid Dilution，MVD），充分混匀后于离心机中4 000 r/min 离心10 min后取上清液加入等量稀释剂Ⅱ，稀释至MVD 浓度。

2.3.2 样品干扰试验溶液制备

取细菌内毒素工作标准品1 支，检查瓶肩以上是否有粉末，若有粉末则轻弹瓶壁使之落下，然后根据已有划痕开启工作标准品，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。然后用BET 水1.0 mL 溶解，在旋涡混匀器上混匀15 min，用供试品溶液于经干烤除热原的试管中进行稀释，逐步稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度。

对应内毒素单位分别为0.125 EU/mL、0.06 EU/mL、0.03 EU/mL 和0.015 EU/mL。

2.3.3 鲎试剂标识灵敏度对照系列溶液

用细菌内毒素检查用水代替珍珠岩溶液将细菌内毒素工作标准品稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度。阴性对照为BET 水。

2.3.4 加样

取规格为0.1 mL/支的鲎试剂28 支。每支加入0.1 mL 检查用水溶解，充分溶解后将鲎试剂溶液混合一起。

分别加入已制备好的上述溶液0.1 mL 细菌内毒素检查用水复溶好的鲎试剂中。2λ、λ、0.5λ、0.25λ的样品干扰试验溶液每一浓度加4 支管，2λ、λ、0.5λ、0.25λ的鲎试剂标识灵敏度对照系列溶液每一浓度加2 支管，取2 支管加入BET 水作为阴性对照，加样体积均为0.1 mL。取2 支管加入珍珠岩细菌内毒素检查溶液，加样体积均为0.1 mL，见表1。

2.3.5 保温

加样结束后，将鲎试剂混匀，37 ℃保温60 min±2 min。

2.3.6 观察并记录结果

将鲎试剂管从电热恒温水浴箱中轻轻取出，倒转180°且动作须轻缓，若管内形成的凝胶不变形、滑脱者为阳性，记录（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形、滑脱者为阴性，记录（-）。

2.3.7 结果判定

当溶液A 和D 所有平行管都为阴性，并且溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当溶液B 的结果符合鲎试剂灵敏度复核要求时认为获取的珍珠岩细菌内毒素检查溶液无干扰作用。其他情况则认为存在干扰作用。

2.3.8 试验方法与结果

取珍珠岩2.0 g，加入16.0 mL 细菌内毒素检查用水，充分混匀后于离心机中4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀释剂Ⅱ2.2 mL，混匀作为珍珠岩溶液，实验结果见表2。

表2 鲎试剂标识灵敏度对照溶液实验结果

通过以上试验结果可知，珍珠岩采用细菌内毒素检查用水稀释8 倍充分混匀后于离心机中4 000 r/min离心10 min，取上清液适量与等量稀释剂Ⅱ混匀后所得供试品溶液能很好地排除干扰，珍珠岩在上述处理方式下对细菌内毒素检查无干扰作用，珍珠岩干扰实验成立。

2.4 干扰实验

2.4.1 珍珠岩未经干烤

取样品2.0 g，加入16.0 mL 细菌内毒素检查用水，充分混匀后于离心机中4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀释剂Ⅱ2.2 mL，混匀作为供试品溶液，实验结果见表3。

表3 珍珠岩未经干烤干扰实验结果

2.4.2 珍珠岩经180 ℃保持3 h 干烤

为了去除珍珠岩中细菌内毒素，样品经180 ℃保持3 h 干烤后样品取样品2.0 g，加入16.0 mL 细菌内毒素检查用水，充分混匀后于离心机中4 000 r/min 离心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀释剂Ⅱ2.2 mL，混匀作为供试品溶液，实验结果见表4。

表4 样品经180 ℃保持3 h 干烤干扰实验结果

通过以上试验结果，得出样品经180 ℃保持3 h干烤后与未经180 ℃保持3 h 干烤实验均有效，供试品在该浓度下无干扰作用，珍珠岩干扰试验成立。

2.4.3 正式干扰试验

使用3 批不同批号鲎试剂及未前期处理（未经过180 ℃保持3 h 干烤去除细菌内毒素）的两批不同批号珍珠岩按照干扰试验的操作步骤进行试验，实验结果见表5。

表5 干扰实验结果

鲎试剂灵敏度对照系列溶液的结果符合鲎试剂灵敏度复核要求，试验有效。样品珍珠岩干扰试验系列溶液中所有试验中阴性对照溶液和样品溶液的所有平行管均为阴性，最大浓度2λ的4 管均为阳性，最低浓度0.25λ的4 管均为阴性，供试品珍珠岩在该浓度下无干扰作用。鲎试剂批号为1812263 的标示灵敏度对照系列的阳性结果与样品干扰试验阳性结果一致，并符合鲎试剂灵敏度复核要求，因此检验结果无异常。

3 结论

（1）检测珍珠岩细菌内毒素的鲎试剂选择标示灵敏度为0.06 EU/mL。（2）将供试品加细菌内毒素检查用水将供试品稀释8 倍混匀4 000 r/min 离心10 min 提取后，选择经过验证不含内毒素和干扰因子的稀释剂Ⅱ与供试品按照1 ∶1 的比例进行稀释，能排除样品对细菌内毒素检查的干扰。