基于网络药理学探讨盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的作用机制

詹洁莹，李国全，滕希峰,4，李芷瑶，张轶君，何琳,2*

（1.广东药科大学，广东广州 510006；2.广东省化妆品工程技术研究中心，广东中山 528458；3.广州市慈善服务中心（广州市慈善医院），广东广州 510030；4.国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，广东广州 510006）

盐酸雷洛昔芬（Raloxifene Hydrochloride，RLX）是第一个被美国FDA 批准用于治疗绝经后骨质疏松症的第二代选择性雌激素受体调节剂（Selective Estrogen Receptor Modulators，SERMs）[1]。它对骨组织的雌激素受体表现为促进作用，而对乳腺及子宫的雌激素受体表现为抑制作用[2]，能发挥类似雌激素减少骨量流失作用，且对乳腺及子宫内膜无副作用，不会引起乳腺癌及子宫癌的发生，可作为预防和治疗绝经后骨质疏松的药物。目前认为盐酸雷洛昔芬主要通过与亲和力高的雌激素受体结合以及基因表达的调节两方面发挥作用，其作用机制还有待进一步研究。

网络药理学是一种与系统生物学、计算机科学、药理学及生物信息学等结合的新兴学科，基于“疾病-基因-靶点-药物”的共同网络，可推测药物与疾病的关系，节省药物研发时间及费用[3]。本研究采用网络药理学方法，将药物（盐酸雷洛昔芬）的靶点与疾病（绝经后骨质疏松症）的靶点进行交集靶点的匹配，采用生物信息学分析结果，构建“盐酸雷洛昔芬-绝经后骨质疏松症-靶点”网络及可视化的蛋白相互作用（PPI）网络，从生物网络平衡的角度展开科学阐述，为探究作用机制及新药研发思路提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 盐酸雷洛昔芬、绝经后骨质疏松症的靶点挖掘

搜索GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），以“Raloxifene Hydrochloride”“postmenopausal osteoporosis”作为关键词分别检索相关靶点,并将检索后的结果进行标准化处理及统计分析，筛选得到Relevance score ≥1 的药物及疾病的靶点。

1.2 交集靶点的获取

将1.1 项下得到药物靶点及疾病靶点，通过软件Venny 2.1 得到交集靶点，并绘制韦恩图。

1.3 可视化PPI 网络的构建

将1.2 项下的结果输入String 11.0 数据库（https://cn.string-db.org），蛋白种类设置为人类，最低交互要求分数参数设置为高可行度（0.900），隐藏网络当中断开连接的节点，其余参数均选择默认设置，导出PPI 的数据文件，构建蛋白之间的网络。下载TSV 格式的蛋白互作关系文件导入可视化Cytoscape 3.9.1 软件，构建PPI，并筛选核心靶点和关键靶点。

1.4 Hub 基因挖掘

通过Cytoscape 3.9.1 软件中Cytohubba 插件的MCC 算法，计算筛选得到排名前10 位的Hub 基因。

1.5 靶点的GO 分析及KEGG pathway 分析

将1.4 项下的结果输入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），通过基因本体（Gene Ontology，GO）分析及KEGG pathway 信号通路分析，得到目标基因在细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）和生物过程（Biological Process，BP）3 个层面上的定位以及主要参与的信号通路。以P＜0.05 和错误发现率（FDR）＜0.05作为筛选条件，筛选具有显著差异的结果。通过气泡图的形式，以Rich Factor 为X 轴，以GO term 名称为Y 轴，将富集结果的P值以颜色表示，基因数（Count）用气泡大小表示，其中颜色由浅变深代表P值逐渐减小，富集的程度越显著；气泡由小到大代表富集到该条目的基因数逐渐增加。

2 结果与分析

2.1 盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的潜在靶点预测

通过Genecards 数据库获得盐酸雷洛昔芬的靶点310 个，获得绝经后骨质疏松症的靶点1 198 个，经过Relevance score ≥1 筛选后，得到盐酸雷洛昔芬靶点268 个，绝经后骨质疏松症靶点944 个。采用Venny 2.1软件绘制韦恩图，筛选出168 个共有靶点，即盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的潜在靶点有168 个，结果如图1 所示。

图1 盐酸雷洛昔芬与绝经后骨质疏松症靶点韦恩图

2.2 药物-疾病共同靶点相互作用分析

通过String 11.0 数据库绘制PPI，收集到149 条交集靶点的相互作用关系，该网络关系包括149 个节点和1 224 条边，说明靶点之间存在紧密的联系。将上述靶点信息用TSV 格式导入可视化Cytoscape 3.9.1软件中，构建药物-疾病共同靶点相互作用关系图，见图2。节点代表靶点蛋白，边代表各靶点蛋白之间的相互关系，节点连接边数越多则代表其在网络中作用越重要，节点的大小及颜色的深浅则与该靶点蛋白的中心度（Degree Centrality，DC）呈正相关。

图2 盐酸雷洛昔芬与绝经后骨质疏松症共同靶点的PPI 网络

2.3 Hub 基因挖掘结果

通过可视化软件Cytoscape 3.9.1 中Cytohubba 插件的MCC 算法计算得到排名前10 的Hub 基因分别为信号传导和转录激活因子3（STAT3）、肉瘤基因（SRC）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、雌激素受体1（ESR1）、JUN 原癌基因（JUN）、磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（PIK3R1）、FOS 原癌基因（FOS）、SP1 转录因子（SP1）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）和MYC 原癌基因（MYC），即盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的关键基因，以上靶点相互作用关系如图3 所示。其中颜色深浅与MCC 算法结果呈正相关，节点大小则与度中心性呈正相关。

图3 排名前10 的Hub 基因相互作用关系图

2.4 靶点的GO 分析及KEGG pathway 分析结果

将2.1 项下预测得到的168 个共同靶点输入DAVID 数据库中进行GO 分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05和FDR＜0.05作为筛选条件，得到结果如下。GO 分析收集到541 个条目，其中BP 有428 个条目、CC 有38 个条目、MF 有75 个条目；KEGG 通路分析得到146 条通路。利用R 语言通过R studio 软件对以上各项P值排名前10 的条目进行可视化，即图中气泡越大、颜色越深，则富集的基因数目越多，富集越显著，见图4、图5。

图4 盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的靶点的GO 分析

图5 KEGG 通路富集分析

在BP 中，涉及药物的反应、基因表达的正调控、细胞增殖的正调控、脂多糖反应等；在CC 中，盐酸雷洛昔芬与绝经后骨质疏松症的共同靶点大多存在于细胞外间隙以及胞膜外区；在MF 中，主要涉及类固醇的结合、酶的结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子的结合、相同蛋白质的结合等，这些信息都提示了盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症可能通过多靶点多种生物学功能整体调节。KEGG 富集分析表明信号通路与癌症、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt 等相关，这些信号通路可能是盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。

3 讨论

有研究发现，非受体酪氨酸激酶（SRC）的c-Src蛋白是破骨细胞活化所必需的物质，且可对成骨细胞活化进行负调控，其高度活化或过量表达可促进骨质疏松症的发生和发展。目前，将c-Src 蛋白抑制剂应用于治疗骨质疏松症还处于临床实验和动物实验阶段，有望成为新的研究趋势[4]。此外，异常激活的SRC 蛋白与许多肿瘤相关，并且其活性的高低与肿瘤的发展密切相关，具体机制包括促进癌细胞增殖、对癌细胞激动蛋白骨架的重组、引发生长机制侵袭转移以及诱导血管形成等[5]。

丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）与丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是细胞外信号调节激酶（MAP）家族的成员。雌激素通过激活靶向软骨细胞内雌激素受体，改变相关酶活性如MAPK，从而发挥生物学功能。ERK 信号作为丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）家族成员中的一员，在参与调控细胞的凋亡与增殖过程中发挥重要作用[6]。研究发现MAPK 信号通路既可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和增殖、阻断破骨细胞的生成，还可提高与成骨相关的因子如碱性磷酸酶（ALP）、Runx2、Ⅰ型胶原蛋白等表达从而治疗骨质疏松症[7]。

雌激素受体1（ESR1）是由雌激素介导、选择性雌激素受体调节剂发挥生物学作用的核内生物大分子，具有雌激素结合域。雌激素受体分布在人的成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和骨髓基质细胞中。雌激素具有提高骨密度、防止绝经后骨丢失的作用。通常雌激素受体结合雌激素后，可抑制破骨细胞的溶酶体活性，降低破骨细胞在骨表面产生陷窝的能力。有研究报道，软骨细胞中的雌二醇（E2）靶向激活ESR1 后，可抑制细胞外信号调节激酶（ERK2）的磷酸化，通过增加自身自噬通量，减少软骨细胞的凋亡[6,8-9]。

原癌基因JUN 具有转录水平快、快速激活的特点。可以通过与自身JUN 蛋白形成同源二聚体或与Fos 蛋白形成二聚体AP-1，起到转录因子的作用。该转录因子与靶基因上调节区AP-1 位点结合后作用于成骨细胞中，调控成骨细胞相关基因的表达，影响着成骨细胞的分化、成熟及功能[10]。JUN 属于AP-1 转录因子家族，是Jak/Stat 信号通路上的基因，具有促进成骨细胞增殖、分化的作用，可以补偿骨缺损部位的骨量并促进其骨钙化组织形成，加速骨折愈合[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R1）与胰岛素的代谢有关，在本研究中可猜测PIK3R1 与内分泌抵抗通路相关，通过激活内分泌抵抗通路调控骨代谢。

PI3K/Akt 信号通路在骨质疏松症中发挥着重要作用，既参与调控成骨细胞的增殖、分化，又是RANKL 诱导破骨细胞生成的重要通路。RANKL/RANK 复合物可导致破骨细胞PI3K 激活和Akt 磷酸化，进一步上调破骨细胞相关的重要转录因子c-Fos，介导破骨细胞分化和成熟，Akt1 在成骨细胞和破骨细胞分化中发挥着重要作用，Akt1 敲低会升高Runx2 水平，促进成骨细胞分化，还能降低破骨细胞特异性mRNA 表达、抑制破骨细胞分化[12]。

KEGG 通路分析盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症与AGE-RAGE 信号通路相关，但是没有找到直接证据推测AGE/RAGE 信号通路是否具有增加成骨的功能。文献报道脂质和动脉粥样硬化通路可诱导炎症细胞因子、TNF-α 和IL-1 的产生及增加，衰老诱发氧化应激，更年期因为性激素减少导致了RANKL 激活剂增加，引起骨质疏松和血管钙化，导致钙从骨骼转移到血管壁[6]。

4 结论

本研究采用网络药理学手段预测了盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症的作用靶点以及可能参与的信号通路，筛选出药物与疾病有168 个共同靶点；关键靶点涉及STAT3、SRC、MAPK1、ESR1、JUN、PIK3R1、FOS、SP1、MAPK14 和MYC 等。盐酸雷洛昔芬治疗绝经后骨质疏松症可能是通过调节STAT3、SRC、MAPK1、ESR1 和JUN 等关键基因，这些结果为下一步实验研究提供了理论参考，后续会采用模型动物、细胞等药理学媒介在体内外进一步探讨其作用机制。