基于网络药理学及分子对接分析益气复脉粉针剂预防心肌缺血再灌注损伤的作用机制

王俊鹏，何正大

（中国药科大学 中药学院，江苏南京 211112）

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是一种十分严重的心血管疾病，威胁着人们的生命和健康。目前最有效的治疗方法是通过血运重建从而快速恢复冠状动脉血流，使血液再灌注[1]。但是在血流恢复后部分患者的病情会出现加重的情况，这引起了临床医生和研究者们的注意。

1960 年，研究者在通过结扎实验狗的冠状动脉导致心肌缺血的研究中发现了再灌注本身就可以加重心肌损伤，增加梗死面积，他们把这种心肌组织在短暂缺血之后恢复血流而导致组织进一步损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI）[2-3]。MIRI 包括多种不同的病理生理过程，如线粒体膜损伤、一氧化氮代谢紊乱、免疫激活、细胞凋亡及自噬等。以往的研究表明，MIRI 过程中将会破坏机体氧化和抗氧化过程，致使脂质发生过氧化，最终对微血管和组织细胞造成不可逆的损伤[4]。

近年来，人们对于MIRI 机制的认识已取得了长足的进步，但现有的临床治疗效果依然有限。中药复方具有多角度、多靶点的诊疗效果，其在预防心肌缺血再灌注损伤方面产生的作用受到研究者的广泛关注，以期改善MIRI 患者所面临的损伤风险。益气复脉粉针剂（YQFM）是参麦方的一种现代临床应用形式，源于古方“生脉散”，由红参、麦冬、五味子3种中药组成，具有益气生津、敛阴止汗的功效。其中，红参作为君药，能大补元气、鼓舞清阳；麦冬作为臣药，能养阴生津、清心除烦；五味子用为佐使，能敛肺宁心、止汗生津；诸药配伍以共奏益气复脉、养阴生津之功[5]。YQFM在临床上常用于治疗冠心病、心力衰竭心肌病等。

网络药理学是融合系统生物学、分子药理学、网络生物学等多学科的一门新技术，通过研究药物在整体网络中与某个特定节点之间存在的相互生物作用关系，进而从系统与整体角度探索并解释药物与机体相互作用的机制[6]。计算机辅助药物设计（CADD）方法当前被广泛用于提高药物设计的效率。AutoDock软件通过模拟小分子产物于蛋白质受体中不同位置相同能量下的构象变化，预测分子的作用位点[7]。

本研究采用网络药理学与分子对接方法，初步研究YQFM 预防MIRI 的相关核心生物成分、关键信号通路与分子动力学过程，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 使用软件及相关线上数据库

本研究使用的软件和相关的数据库见表1。

表1 使用的软件及数据库

1.2 益气复脉粉针剂活性成分筛选及靶点预测

使用中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和中医药整合药理学研究平台（TCMIP）对红参、五味子和麦冬关键词进行检索，可得到对应的药物化学成分。类药性（Druglikeness，DL）是通过比对已知药物与目标化合物的相似性，从而初步对其成药可能性进行打分的标准[8]。对于TCMSP 中的成分数据，设定DL ≥0.18，筛选得到的成分为潜在的活性成分[9]；对于TCMIP 中的成分数据，则根据Druglikeness Grading 一项筛选标记为Moderate 或Good，且将之化学成分导入SwissADME 数据库中，将DL 一 栏5 项（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中有3 项及以上为Yes 的成分作为潜在的活性成分[10]。此外，结合文献，根据相关领域研究，将不符合上述标准但经实验认定可能是有效成分的化合物也纳入考量范围[11-13]。使用Pubchem 获得前述备选化学成分的2D 结构与InChiKey，导入SwissTargetPrediction 数据库，物种选择“智人”（Homo Sapiens），以probability ＞0 为筛选条件预测其作用靶点，整理汇总相关数据，得到YQFM 中的活性成分作用靶点。

1.3 MIRI 靶点收集筛选

使用DrugBank、OMIM、GeneCards 数据库，以“myocardial ischemia reperfusion injury”为关键词进行查询，获取心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的相关基因靶点，对所得结果去重后建立MIRI 的潜在靶点数据库，将之同YQFM 的活性成分作用靶点进行比对并取交集，得到YQFM-MIRI 共同靶点。

1.4 益气复脉核心成分与候选靶点的筛选与获取

将所得的YQFM-MIRI 共同靶点导入Cytoscape 3.8 软件，构建“成分-靶点”网络，分析网络关键拓扑参数，根据Degree，Betweenness Centrality，Closeness Centrality 大于中位数这一标准获取候选靶点。

1.5 蛋白互作网络（PPI）的形成以及核心靶点的筛选与分析

将所得到的候选靶点导入String 数据库，物种设置为“Homo Sapiens”，构建蛋白相互作用（PPI）网络。使用CytoScape 3.8 对所得的数据进行处理。

1.6 GO 功能及KEGG 通路富集分析

使用MetaScape 数据库对候选靶点进行GO 富集分析与KEGG 通路富集分析，将P＜0.05 作为具有生物学意义的临界值，绘制生物学过程GO 分析条形图与KEGG 通路条形图。

1.7 分子对接

使用PDB 数据库与AlphaFold 数据库获得所需的蛋白质结构文件，使用PubChem 获取所需的化学成分分子的3D 结构文件，不具有3D 结构的化学成分分子，则使用Chem3D 19.0 构建最小化化学能的分子结构。使用AutoDock Tools 1.5.7 处理由先前筛选所得到的小分子配体与靶蛋白，并使用Vina 将核心成分与靶蛋白进行分子盲对接（Blinding Dock）操作，对对接产生的聚合体进行评定，记录对接完成后分子在蛋白质空间构象中的相对位置，并输出对接打分（结合能），使用GraphPad Prism 8 对数据进行热图分析，使用Pymol 2.6 软件和ProteinPlus 对分子对接结果进行处理。

2 结果与分析

2.1 益气复脉粉针剂中的治疗靶点与核心成分

使用TCMSP 与TCMIP 数据库筛选得到的药物活性化学成分共计104 个，其中红参成分35 个、五味子成分50 个、麦冬成分19 个。基于SwissTargetPrediction 数据库与TCMSP 数据库预测红参活性成分对应基因靶点有53 个，五味子活性成分对应基因靶点有55 个，麦冬活性成分对应的基因靶点有123 个，合并并去除重复靶点后可得出YQFM共含有潜在作用靶点189 个。通过检索OMIM、GeneCards、DrugBank 数据库并去除重复项后总结出MIRI 相关靶点1 215 个。将二者进行匹配，可得知YQFM 可调控MIRI 相关的33 个潜在靶点（图1）。以这33 个潜在靶点搜索并统计YQFM 的活性成分数据库，发现有49 个活性成分为预防MIRI 的有效成分。构建“成分-靶点”网络进行拓扑参数分析（图2），根据前文所述的条件进行筛选，发现人参皂苷Rh2、人参皂苷Rf、β-谷甾醇、戈米辛S、戈米辛T 和麦冬二氢高异黄酮B 可能是YQFM 预防MIRI 的核心成分（表2）。

图1 成分-疾病共同靶点韦恩图

图2 “成分-靶点”网络

表2 YQFM 核心成分

2.2 YQFM 预防MIRI 的蛋白互作网络（PPI）构建

使用String 数据库对上述内容中取交集得到的33 个共同靶点进行处理，物种选择“Homo Sapiens”（智人），构建蛋白相互作用PPI 网络（图3）。使用Cytoscape 3.8 软件对PPI 网络进行处理，经分析可知网络共有33 个节点，160 条边，网络平均度数为9.7，其中颜色的深浅与节点大小代表着节点的度数，使用Centiscape 2.2 插件对其进行进一步分析，计算出其中得分较高的靶点，处理结果见图3，节点的度数越大，则表明该节点的生物学功能越重要，越可能是影响MIRI 发生的基因靶点。结果显示，内皮一氧化氮合成酶（NOS3）、肾上腺素能受体B2（ADRB2）、肿瘤坏死因子（TNF）、过氧化物酶体增生激活受体γ编码基因（PPARG）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）与其他蛋白的关联程度相对较大，这些靶点极可能是YQFM 预防MIRI 的关键作用靶点。

图3 关键靶点蛋白关系网络

2.3 潜在靶点GO 富集与KEGG 富集分析结果

使用MetaScape 数据库以P＜0.05 为标准进行GO分析（图4A）与KEGG分析（图4B），X轴为-log10(P)，Y 轴为富集条目或途径；图中颜色越深P值越大。GO 预测YQFM 中核心成分主要参与的生物过程关键指标，如节律过程、血液循环、平滑肌细胞增殖调节和血压调节等关键指标。KEGG 富集分析结果表明，脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌症蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）、癌症通路（Pathways in cancer）和化学致癌-受体激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）与YQFM 预防MIRI的作用机制密切相关。

图4 富集结果

2.4 分子对接结果

使用AutoDock Vina 1.1.2 对YQFM 中的6 种核心成分与上述的8 个关键靶点进行亲和力研究和分子结合模式模拟，使用GraphPad Prism 8 软件统计并处理输出热图。如图5 所示，结合能均≤-5 kcal/moL，表明分子与目标蛋白之间存在较好的结合能力。选取其中具有代表性的分子对接结果，使用ProteinPlus绘制二维对接图进行展示，见图6。

3 讨论与结论

通过网络药理学方法研究发现，YQFM 发挥药效的有效成分为33 个，其中以β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rf 为首的共6 种成分可能是YQFM 在预防MIRI 过程中发挥药效的主要活性物质。近些年，有研究表明β-谷甾醇通过提高超氧化物歧化酶表达间接降低活性氧水平，从而降低心肌炎症反应[14]；人参皂苷Rh2 是一种药理作用广泛的化学物质，邵恳等[15]经动物实验研究发现其通过增加大鼠MIRI 后外周血内皮祖细胞的数量从而对大鼠受损心肌发挥保护作用；人参皂苷Rf 能抑制COX-2 蛋白表达，后者一般在缺氧条件下被诱导激活，产生一系列的炎症介质，这说明人参皂苷Rf 能够对缺氧的心肌细胞产生一定的保护，具有抗炎活性[16]。

通过GO 功能分析发现YQFM 可能通过参与节律过程、血液循环、平滑肌细胞增殖调节和血压调节等生物进程发挥其预防MIRI 的作用。KEGG 富集分析结果则显示，YQFM 与MIRI 的关键候选基因SRC、PPARG、NOS3、TNF、CASP3 均富集于脂质与动脉粥样硬化通路。实验证据支持TNF 在MIRI 中以活跃形式存在，且通过抑制炎性细胞因子TNF-α 的表达可起到缩小心肌梗死面积，减轻MIRI的效果[17]；NOS3 是参与血管生成调控的关键基因，NOS3 水平的升高可以缓解MIRI 的发作程度[18]；近年的研究关注到PPARG 的磷酸化激活可以显著缓解心律失常与心肌细胞氧化应激和凋亡，而抑制PPARG 的表达则会促进MIRI 诱发严重心律失常[19]；PTGS2 是前列腺素-过氧化物内酯合酶的一种亚型，其在炎症反应中起到了特定的作用，当前研究表明，抑制PTGS2 可减少心肌梗死的炎症反应并且改善心肌重塑效果[20]。

综上所述，本研究通过运用网络药理学与分子对接方法初步对益气复脉粉针剂的预防心肌缺血再灌注分子机制做出了解释，并发现益气复脉粉针剂可能是通过人参皂苷Rf、人参皂苷Rh2、β-谷甾醇等核心成分通过作用于TNF、SRC、NOS3、PTGS2、CASP3 等靶点来调控脂质与动脉粥样硬化、血管内皮生长因子信号通路等，从而发挥了对心肌缺血再灌注损伤的预防与治疗作用。本研究为益气复脉粉针剂的药理作用机制相关研究提供了一种思路和方法，为今后深入探讨益气复脉粉针剂对MIRI 的作用机制提供了参考。