超高效液相色谱法测定德谷胰岛素含量

李晴晴，孟盼盼，李敬

（江苏万邦医药科技有限公司，江苏徐州 221004）

糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）属慢性终身性疾病，是一种高发病率、严重影响人们正常生活工作的慢性病[1]。近些年，全球糖尿病患病人数一直在大幅度增加，其中2 型糖尿病（Diabetic Mellitus Type 2，T2DM）患者约占糖尿病患者总数的90%，已经成为威胁人类健康的世界性公共卫生问题。德谷胰岛素（Insulin Degludec，IDeg）为超长效基础胰岛素类似物[2]，注射后形成多六聚体，从可溶性储存库中缓慢释放，能够持久、平稳、长期降血糖，减轻病人的生理痛苦，增强病人顺应性[3-7]，广泛用于2 型糖尿病的治疗[8]。

德谷胰岛素含量检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC），其中紫外分光光度法采用紫外分光光度计进行直接测定，HPLC 通过色谱柱分离作用将有关物质、杂质等进行分离，故结果更为准确可靠[9]。江苏万邦医药科技有限公司现采用HPLC 控制产品中德谷胰岛素含量，德谷胰岛素主峰出峰时间约为22 min,高效液相色谱法分析时间长、系统死体积较大，检测成本高。与传统的HPLC 相比，超高效液相色谱（UPLC）填料颗粒小、均匀，具有柱效高、分析速度快、分离度高、灵敏度好等特点[10-11]，因此被广泛应用于生物化学、药物研究分析等领域[12]。因此，本研究采用UPLC 法测定德谷胰岛素的含量，为提升其质量标准提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30A 超高效液相色谱仪，日本Shimadzu 公司；XS105 分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；ToledoXSR105 电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

无水硫酸钠、磷酸二氢钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，默克股份两合有限公司；德谷胰岛素，江苏万邦生化医药集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件及参数

色谱柱：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A 为0.1 mol/L 硫酸钠溶液（称取无水硫酸钠14.2 g，磷酸二氢钠15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氢氧化钠调节pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混匀）-乙腈（体积比90 ∶10），流动相B 为50%乙腈；梯度洗脱程序：0 ～20 min，50%B；20 ～21 min，50%B ～80%B；21 ～24 min，80%B；24 ～25 min，80%B ～50%B；25 ～30 min，50%B）；柱温：40 ℃；流速：0.25 mL/min；波长：214 nm，进样量：2 μL。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 空白溶液

0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液：称取1.56 g 二水合磷酸二氢钠，加1 000 mL 水溶解混匀后，1 mol/L NaOH调pH 至7.5，混匀，经微孔滤膜（水系0.45μm）过滤后作为空白溶液。

1.2.2.2 系统适用性溶液

取德谷胰岛素适量，60 ℃烘箱放置2 ～5 d，使与主峰保留时间约为1.16 min 的杂质分离度大于2.0。称取以上样品，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，作为系统适用性溶液。

1.2.2.3 对照品溶液

取德谷胰岛素对照品约10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成1 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2.4 供试品溶液

（1）标准曲线溶液：取德谷胰岛素对照品约50 mg，置25 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成2 mg/mL 的对照品浓溶液，分别取对照品溶液适量，配制成约0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、1.0 mg/mL 与1.2 mg/mL 的对照品溶液。

（2）重复性溶液：取德谷胰岛素样品约10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成1 mg/mL 的供试品溶液，平行6 份。

（3）中间精密度溶液：取德谷胰岛素样品约10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成1 mg/mL 的供试品溶液。两名分析人员分别处理6 份，并于不同日期使用不同仪器进行验证测量。

（4）准确度溶液：取德谷胰岛素对照品约8 mg、10 mg、12 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成含德谷胰岛素约80%、100%、120%的供试品溶液，每个浓度分别平行3 份。

（5）稳定性溶液：取德谷胰岛素样品约10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成1 mg/mL 的供试品溶液。在样品配制完成后约0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 与36 h 进样测定，记录色谱图。

（6）耐用性溶液：取德谷胰岛素样品约10 mg，置10 mL 量瓶，用上述0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解并稀释成1 mg/mL 的供试品溶液。分别对柱温（±2 ℃），流速（±0.01 mL/min）与波长（±2 nm）进行微小的变动，每次变动一个因素。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化过程

2.1.1 流动相的选择

流动相①：A 为0.1 mol/L 磷酸盐溶液（称取磷酸二氢铵11.5 g，加水800 mL 溶解，加乙腈100 mL，混匀，用85%磷酸调节pH 值至3.7，加水定容至1 000 mL），流动相B 为80%乙腈。流动相②：A 为0.1 mol/L 硫酸钠溶液（称取无水硫酸钠14.2 g，磷酸二氢钠15.6 g，加水800 mL，溶解后用8 mol/L 氢氧化钠调节pH 值至5.7，加入乙腈100 mL，加水定容至1 000 mL，混匀）-乙腈（体积比90 ∶10），流动相B为50%乙腈。样品色谱检测结果如图1 所示，流动相②峰型对称、响应高、出峰时间早，适合作为流动相使用。

图1 不同流动相检测结果

2.1.2 色谱柱的选择

色谱柱①：Waters C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；色谱柱②：Shim-pack GISS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）。样品检测结果如图2 所示，色谱柱①主峰拖尾因子为0.98，且主峰与主峰后杂质分离效果较好；色谱柱②主峰拖尾因子为1.23，主峰与主峰后杂质不能有效分离，故选择色谱柱①进行样品检测。

图2 不同色谱柱检测结果

2.2 专属性试验

将空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液依次进样，记录色谱图，如图3 所示。色谱结果显示，空白溶液不干扰目标色谱峰检测，专属性良好。

图3 专属性色谱图

2.3 进样精密度试验

对照品溶液依次进样6 次，记录色谱图。峰面积的RSD为0.08%，表明仪器的精密度良好。

2.4 线性与范围

不同浓度下，德谷胰岛素检测峰面积见表1。以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，进行线性回归，得线性方程为y=147.37x-0.018 7，R2=0.999 9。结果显示，在线性范围内，德谷胰岛素峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表1 线性试验结果

2.5 重复性

重复性溶液的RSD为0.05%，见表2，表明该分析方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

2.6 中间精密度

中间精密度溶液的RSD为0.34%，见表3，表明该分析方法中间精密度良好。

表3 中间精密度试验结果

2.7 准确度

回收率测定结果见表4。结果表明，该方法下德谷胰岛素的回收率在99.17%～101.27%，RSD＜5%，方法准确度良好。

表4 回收率试验结果

2.8 稳定性

计算对照品溶液中德谷胰岛素峰面积的RSD与供试品溶液含量的RSD，见表5。对照品溶液中德谷胰岛素峰面积的RSD为0.28%；供试品溶液含量的RSD为0.21%。结果表明，对照品与供试品溶液至少36 h 内稳定。

表5 稳定性试验结果

2.9 耐用性

将柱温（±2 ℃）、流速（±0.01 mL/min）与波长（±2 nm）进行微小的变动，考察方法耐用性，见表6。结果表明，色谱条件进行微小变动时RSD均小于0.5%，方法耐用性良好。

表6 耐用性试验结果

2.10 实际样品测定

分别称取三批德谷胰岛素产品（批号F01、F02、F03）约10 mg，精密称定，置10 mL 量瓶，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液溶解并稀释成浓度为1 mg/mL 的供试品溶液，按照1.2.1 项下色谱条件测定，结果见表7。

表7 实际样品含量测定结果

3 结论

本文建立了检测德谷胰岛素含量的UPLC 方法。该方法下，德谷胰岛素出峰时间约为11 min，与普通高效液相色谱需要的22 min 相比，检测时间缩短了50%，能快速检测出德谷胰岛素含量。该方法专属性强，线性范围广，回收率高，重复性、稳定性及耐用性良好，可用于提升德谷胰岛素含量标准。