王海波,钟 丹,林芷欣,欧绮云,邱贵渝
(广东食品药品职业学院,广东广州 510520)
番石榴(Psidium guajavaL.),又名芭乐、鸡屎(矢)果,为桃金娘科番石榴属的常绿灌木或小乔木,在我国广东、广西、福建等地广泛种植[1-2]。番石榴味道鲜美,具有很高的营养价值,它含有丰富的黄酮类化合物、膳食纤维、氨基酸[3-5],VC含量极高,抗氧化能力极强[6]。番石榴还具有降血糖、抗癌、免疫调节等药理功效[7-8]。
番石榴在采收后果实硬度下降,质地软化[9],产生特有的颜色、香气和滋味,食用品质提升[10]。番石榴是典型的呼吸跃变型果实,采后果实在25 ℃贮藏第4~6 d 的呼吸速率达到最大值,果皮颜色逐渐由黄绿色转变为黄色,果实硬度逐渐下降[11-12]。例如,‘西瓜红’番石榴果实硬度在25 ℃贮藏第6 d 开始迅速下降,‘珍珠’番石榴果实硬度在25 ℃贮藏第8 d 开始迅速下降[13]。不同采收期的番石榴果实采后成熟的速度不同,香气成分也存在较大差异。金怡等[14]研究三个不同采收期对‘红心’番石榴品质的影响,发现‘红心’番石榴果实采后软化迅速,颜色由绿转黄较快,且采收期Ⅰ(果皮绿黄色)较采收期Ⅱ(果皮淡绿黄色)、Ⅲ(果皮黄色)的耐贮性强。
番石榴果实的挥发性物通常采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法(solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometer,SPME-GCMS)进行检测,例如,李国鹏等[15]采用SPME-GCMS 对红肉型‘四季桃’番石榴果实进行香气分析,共检测出62 种挥发性成分,主要是酯类、醇类、醛类等物质。李莉梅等[16]利用SPME-GC-MS 在番石榴中检测到40 种挥发性成分,红肉型‘四季桃’番石榴果实挥发性成分种类要多于白肉型‘珍珠桃’果实,尤其酯类物质的种类和相对含量均较白肉型果实高。类似地,周浓等[17]、马锞等[18]、邱珊莲等[19]均采用SPME-GC-MS 对不同品种的番石榴果实香气进行了分析,发现酯类和醛类是番石榴果实香气的主要成分。近年来,气相离子迁移谱(Gas chromatography-Ion mobility spectrometry, GC-IMS)作为一种新的检测技术在食品检测中得到了广泛应用[20-22]。GC-IMS比传统的GC-MS 灵敏度更高,操作更简便[23-24]。近年来,GC-IMS 法在香蕉[25]、柑橘[26]、黄皮[27]、百香果[28]等水果中用于果实挥发性成分的检测,结果表明,GC-IMS 法检测到的挥发性成分种类远多于GCMS 法,说明GC-IMS 法灵敏度很高。
GC-MS 是番石榴果实挥发性物常用的检测手段,而目前没有关于GC-IMS 在番石榴挥发性成分检测中的相关报道,番石榴果实采后香气增加,食用品质提升,但目前对于不同品种番石榴采后果实香气的比较研究较少。因此,本研究首次采用GCIMS 分析3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期的挥发性成分差异,为鲜食番石榴的品质评价及加工利用提供依据。
番石榴果实 3 种常见的红肉番石榴果实品种为‘西瓜红’、‘红宝石’和‘红珍珠’,分别购自福建漳州、广东湛江和广州南沙,番石榴果实为8~9 成熟且果皮为绿色,即为绿熟期果实;正酮(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮) 分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司。
FlavourSpec®气相离子迁移谱联用仪 德国G.A.S.公司;SRG-1000D4-LED 可调式恒温恒湿储藏柜 杭州硕联仪器有限公司;BSA124S 电子天平德国赛多利斯公司。
1.2.1 样品处理 将绿熟期的番石榴果实洗干净,晾干放可调式恒温恒湿储藏柜中20 ℃贮藏备用。绿熟期的果实置于20 ℃恒温培养箱中贮藏7 d,番石榴果皮颜色转为黄绿色,即为黄熟期。每个处理取6 个果实,除去头尾,取中间部分的果实(包括果皮、果肉和籽),切成边长约1 cm 的方块,混匀,用液氮冷冻置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 GC-IMS 测定方法 每个样品取4.0 g 置于20 mL 顶空瓶中,采用FlavourSpec®气相离子迁移谱联用仪进行测试,重复3 次。顶空进样条件:顶空进样体积:500 μL,孵育时间:15 min,孵育温度:50 ℃,进样针温度:65 ℃,孵化转速:500 r/min;GC- IMS 条件:色谱柱类型:MXT-5,长15 m,内径0.53 mm,膜厚1 μm,分析时间:30 min,柱温:40 ℃,载气/漂移气:高纯氮气(纯度≥99.999 %),IMS 探测器温度:45 ℃;流速:E1(漂移气流速)为:150 mL/min,E2(气相载气流速):初始2 mL/min,保持2 min 后在8 min 内增至10 mL/min,接着在15 min 内增至100 mL/min。
利用GC-IMS 配套的LAV(Laboratory Analytical Viewer)软件绘制差异图谱和指纹图谱。通过仪器内置的NIST 气相保留指数数据库和IMS 迁移时间数据库对3 种番石榴的挥发性成分进行定性分析。利用网站(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)在线对3 种番石榴所有挥发性成分的峰体积进行主成分分析。
利用GC-IMS 配套的LAV 软件绘制3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期的差异图谱如图1 和图2 所示,图1 和图2 中的每个点代表一种物质,白色表示浓度较低,红色表示浓度较高,颜色越深表示浓度越大。从图1 和图2 可知,番石榴果实的挥发性成分能通过GC-IMS 进行很好的分离。利用箭头和方框标记了3 种番石榴差异较大的一些挥发性成分,‘红宝石’和‘红珍珠’番石榴的挥发性成分的组成以及含量的差异均较少,而‘西瓜红’番石榴的挥发性成分的组成与另外2 种番石榴差异较大,且在方框内某些挥发性成分含量明显高于另外2 个品种。总体上,在3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期中,‘西瓜红’番石榴的挥发性成分含量最高,与另外2 个品种差异较大,而‘红宝石’和‘红珍珠’番石榴的挥发性成分含量较低,两者差异较小。
图1 3 种番石榴绿熟期挥发性成分的气相离子迁移谱Fig.1 GC-IMS topographic plots of volatile substances in mature green fruits of 3 kinds of guava
图2 3 种番石榴黄熟期挥发性成分的气相离子迁移谱Fig.2 GC-IMS topographic plots of volatile substances in mature yellow fruits of 3 kinds of guava
如图3 所示,将3 种红肉番石榴绿熟期挥发性成分的指纹图谱分成3 部分(A、B 和C),A 是‘西瓜红’和‘红宝石’显著(P<0.05)高于‘红珍珠’的挥发性成分,B 是2 个品种共有且浓度高于另一个品种的挥发性成分,C 是3 个品种所共有且浓度较高的挥发性成分。在图3 中,3 种红肉番石榴绿熟期共检出121 种挥发性成分,其中已知挥发性成分107 种,未知成分14 种,未知成分用数字1~14 来标记。在107 种已知挥发性成分中,主要包括酯类28 种(占比26.2%)、醛类24 种(占比22.4%)、醇类18 种(占比16.8%)、酮类17 种(占比15.9%)、其他挥发性成分20 种(18.7%)。酯类、醛类和醇类是番石榴果实的主要挥发性成分,这与以往报道一致,但比GCMS 在番石榴果实中检测到的挥发性成分总数要多很多[16-19]。
图3 3 种番石榴绿熟期挥发性成分的指纹图谱Fig.3 Fingerprint of volatile substances in mature green fruits of 3 kinds of guava
从图3A 可知,正己腈(二聚体)、3-辛酮(单体)、3-辛酮(二聚体)、1-戊醇(二聚体)和正己醇(单体)等是‘红宝石’绿熟期的特征挥发性成分。而这5 种成分在‘西瓜红’和‘红珍珠’中含量极低。与‘红宝石’和‘红珍珠’番石榴绿熟期相比,‘西瓜红’绿熟期的挥发性成分最丰富,主要包括顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体和单体)、乙酸丙酯(二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丙醇、苄醇、2-丁烯酸异丁酯、辛醛(二聚体)、1,8-桉叶素(二聚体)等37 种特征挥发性成分。其中,顺-3-己烯基乙酸酯具有强烈的弥散性水果清香香气,有类似梨味道的,它也是红茶中花香、甜香的特征香气成分[29]。MOON 等[30]和SOARES 等[31]研究也发现,顺-3-己烯基乙酸酯是成熟番石榴果实的主要香气成分。另外,与‘西瓜红’番石榴类似,乙酸丙酯、乙酸乙酯和乙酸丁酯等3 种酯类物质也是苹果香气的主要成分[32]。
从图3B 可知,3-甲基丁醛、1-戊醇(单体)、乙酸乙酯(单体)、3-羟基丁酸乙酯、辛醛(单体)、异丁醇、2-戊基呋喃、丁酸-2-甲基丙酯等是‘红宝石’和‘红珍珠’绿熟期共有的特征风味物质。其中,2-戊基呋喃具有果香、青香及类似蔬菜的香味[33],呋喃类化合物的气味阈值低于醛类、醇类和酮类[34],推测2-戊基呋喃对番石榴的香气贡献较大。2,3-二甲基吡嗪、(E,E)-2,4-己二烯醛、1,8-桉叶素(单体)、3-甲基丁酸-2-苯乙酯、柠檬烯(二聚体)、β-罗勒烯(二聚体)等是‘西瓜红’和‘红珍珠’绿熟期共有的特征挥发性成分。乙酸丁酯、丙醛、2-甲基丙酸乙酯、正己醇(二聚体)、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸甲酯、丙酸(二聚体)、2-丁酮(二聚体)等是‘西瓜红’和‘红宝石’绿熟期共有的特征挥发性成分。
图3C 是3 个红肉番石榴品种共有的44 种特征挥发性成分。主要包括:2-己烯醛(二聚体)、己醛(单体和二聚体)、(E)-2-庚烯醛、壬醛、丁醛、庚醛、苯乙醛、反式-2-戊烯醛(二聚体)、柠檬烯(单体)、β-罗勒烯(单体)、γ-松油烯、(Z)-3-己烯-1-醇(二聚体)、1-戊烯-3-酮(二聚体)等组分。其中醛类物质较多,醛类阈值较低,对香气贡献很大。2-己烯醛、己醛和庚烯醛具有草香味[30-31];壬醛具有柑橘香、脂肪香、花香[35];丁醛具有清香味;庚醛具有强烈的油脂气味;苯乙醛呈强烈风信子香气,低浓度时有杏仁、樱桃香味;反式-2-戊烯醛具有土豆和豌豆似香气[33]。3 个番石榴品种均含有较高的柠檬烯、β-罗勒烯、γ-松油烯等萜烯类化合物,这3 种萜烯类化合物也是芒果的主要香气成分[36]。萜烯类化合物阈值普遍较低,赋香作用明显[33]。其中柠檬烯具有柠檬香味,它是番石榴花[37]、番石榴果实[38]、番石榴果粉[39]中的主要香气成分。柠檬烯可以作为食品香精香料添加剂,同时也具有镇咳、祛痰、抑制肿瘤、治疗胆结石、胆囊炎等药用功效[40]。
3 种红肉番石榴黄熟期挥发性成分的指纹图谱如图4 所示,其中A 是‘西瓜红’显著高于另外2 个品种的挥发性成分,B 是‘红宝石’和‘红珍珠’共同含有且浓度高于‘西瓜红’的挥发性成分,C 是3 个品种所共有且浓度较高的挥发性成分。3 种红肉番石榴黄熟期共检出133 种挥发性成分,其中已知挥发性成分114 种,未知成分19 种,黄熟期挥发性成分总数比绿熟期多12 种。在114 种已知挥发性成分中,主要包括酯类32 种(占比28.1%)、醛类24 种(占比21.0%)、醇类18 种(占比15.8%)、酮类18 种(占比15.8%)、其它挥发性成分22 种(占比19.3%)。
图4 3 种番石榴黄熟期挥发性成分的指纹图谱Fig.4 Fingerprint of volatile substances in mature yellow fruits of 3 kinds of guava
图4A 是‘西瓜红’黄熟期的特征风味物质,主要包括己酸乙酯(单体和二聚体)、顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体)、乙酸甲酯(单体和二聚体)、乙酸丙酯(单体和二聚)、丙酸乙酯、丁酸甲酯、辛醛(二聚体)、戊醛、2-甲基丙醛、2-甲基-2-丙醇、异丙醇、苄醇、2-戊酮、丙酮等物质。己酸乙酯和乙酸己酯的香气值很高,是红肉‘四季桃’番石榴的两种主要酯类香气物质[16]。本研究3 种红肉番石榴黄熟期(图4)和绿熟期(图3)均含有己酸乙酯,其中‘西瓜红’含量最高,但未能检测出乙酸己酯,这可能是由于不同的红肉番石榴品种差异造成。
图4B 是‘红宝石’和‘红珍珠’黄熟期共有的特征性挥发性成分,主要包括α-蒎烯(二聚体)、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸甲酯、异戊酸甲酯等是‘红宝石’黄熟期的特征性挥发性成分。辛醛(单体)、壬醛、乙酸乙酯(单体)、乙硫醚、3-羟基丁酸乙酯、丁酸-2-甲基丙酯、丁酸正戊酯、1-戊醇(单体)、乙酸丁酯等物质。在EGEA 等[41]的研究中,‘草莓’和‘柠檬’2 种番石榴果实中含有较高的具有柑橘类香气的辛醛和壬醛,且两者对番石榴的香气贡献较大,本研究中这两个醛类物质含量较高与前人研究结果相似。
从图4C 是3 种番石榴黄熟期共有的51 种特征风味物质,主要包括β-罗勒烯(单体和二聚体)、柠檬烯(单体)、γ-松油烯、α-水芹烯、2-己烯醛、己醛(单体和二聚体)、庚醛(二聚体)、(Z)-3-己烯-1-醇(二聚体)、(E)-2-己烯-1-醇等物质。萜烯类化合物是本研究3 种红肉番石榴果实的重要香气贡献物质,这与邱珊莲等[19]在5 种番石榴中的研究结果基本一致,该研究认为β-罗勒烯、桉叶素、胡椒烯、石竹烯等萜烯类化合物是5 种番石榴的主要香气成分。柠檬烯对番石榴香气的贡献值很大,是番石榴的重要香气成分[42]。
从表1 可知,3 种番石榴的峰体积较高的挥发性成分包括反式-2-丁烯酸乙酯、2-己烯醛、己醛(二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)、(Z)-3-己烯-1-醇(二聚体)、1-戊烯-3-酮(二聚体)、反式-2-戊烯醛(二聚体)和己醛(单体)等7 种物质,说明这些物质是3 种红肉番石榴的主要香气物质,这与之前一些学者的研究结果类似。例如,邱珊莲等[43]采用SPME-GC-MS 对番石榴果实的不同成熟期进行检测,发现己醛和3-己烯醛是完熟番石榴果实的主要香气成分。类似地,己醛和2-己烯醛是红肉‘四季桃’、白肉‘珍珠桃’[15]、‘新世纪’等多个番石榴品种果实的主要香气成分[18]。李国鹏等[15]利用GC-MS 检测发现红肉‘四季桃’番石榴果实有7 种特征香气组分,分别为己醛、2-己烯醛、丁酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和乙酸己酯,其中草香型的己醛和2-己烯醛及果香型特征的己酸乙酯对果实香气的贡献率较大。采用GC-MS 对未成熟、成熟中期和成熟的番石榴果实挥发性成分进行分析发现,在未成熟果实和成熟中期果实,挥发性成分主要包括(E)-2-己烯醛和(Z)-3-己烯醛。在成熟水果中,挥发性成分主要包括顺-3-己烯基乙酸酯、石竹烯和α-律草烯等组分[30]。对27 种番石榴果实的未成熟、绿熟和黄熟三个采收期的香气物质进行研究发现,己醛、(E)-2-己烯醛和(E)-石竹烯等在所有番石榴品种以及番石榴的三个采收期都广泛存在,而顺-3-己烯基乙酸酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯等则主要存在于黄熟番石榴果实中[31]。反式-2-丁烯酸乙酯的峰体积在3 种番石榴中含量很高,这与李莉梅等[16]报道的结果相反,该研究在‘四季桃’和‘珍珠桃’检测到的反式-2-丁烯酸乙酯含量非常低,推测可能是由于番石榴的品种差异所造成。
根据表1,通过分析3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期主要挥发性成分的差异,可以进一步了解番石榴果实在后熟过程中的各类香气物质相对含量的变化。在44 种主要挥发性成分中,‘西瓜红’黄熟期有30 种挥发性成分的峰体积要高于‘西瓜红’绿熟期,有14 种低于绿熟期。‘西瓜红’番石榴经过后熟,峰体积大幅增加的物质有:γ-松油烯、1,8-桉叶素(单体)、2-戊基呋喃、己醛(二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)、丙醛、乙酸丙酯(二聚体)等。‘西瓜红’番石榴经过后熟,峰体积大幅降低的物质有:2-甲基-1,3-二氧戊环-2-乙酸乙酯、β-罗勒烯(单体)、甲基庚烯酮、顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体)、1-丙醇,2-甲基-2-丙醇等。其中,β-罗勒烯是一种与植物防御启动密切相关的信号分子。Eugenia dysenterica果实中β-罗勒烯的含量随着果实成熟度增加而降低[44],本研究中同样3 种番石榴果实的β-罗勒烯(单体)含量均随着果实成熟度增加而降低。
‘红宝石’黄熟期有26 种挥发性成分的峰体积要高于‘红宝石’绿熟期,有18 种低于绿熟期。‘红宝石’番石榴经过后熟增加的物质有乙酸乙酯(二聚体)、γ-松油烯、1,8-桉叶素(单体)、3-甲基丁酸-2-苯乙酯、顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体)、反式-2-戊烯醛(二聚体)和1-戊烯-3-酮(二聚体)等。‘红宝石’番石榴经过后熟降低的物质有β-罗勒烯(单体)、2-戊基呋喃、反式-2-丁烯酸乙酯、正己腈(二聚体)和丙醛等。
‘红珍珠’黄熟期有31 种挥发性成分的峰体积要高于‘红珍珠’绿熟期,有13 种低于绿熟期。‘红珍珠’番石榴经过后熟大幅增加的物质有乙酸乙酯(二聚体)、γ-松油烯、1,8-桉叶素(单体)、顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体)、反式-2-丁烯酸乙酯、(5-甲基-2-呋喃基)甲醇和等,红珍珠番石榴经过后熟大幅降低的物质有β-罗勒烯(单体)、2-戊基呋喃和己醛(单体)等。
综上,3 种番石榴果实在后熟过程中均大幅增加的挥发性成分有:γ-松油烯、1,8-桉叶素(单体)、反式-2-戊烯醛(二聚体)、1-戊烯-3-酮(二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)等,大幅减少的挥发性成分有:β-罗勒烯(单体)、甲基庚烯酮等。反式-2-丁烯酸乙酯在‘西瓜红’和‘红珍珠’后熟过程中大幅增加,而在‘红宝石’后熟过程中大幅减少。己醛(二聚体)在‘西瓜红’和‘红宝石’后熟过程中大幅增加,而在‘红珍珠’后熟过程中大幅减少。2-戊基呋喃在‘西瓜红’后熟过程中大幅增加,而在‘红宝石’和‘红珍珠’后熟过程中大幅减少。而2-己烯醛在3 种番石榴绿熟期和黄熟期中的含量差异不大。
选取3 种番石榴绿熟期的121 种挥发性成分的峰体积作为特征变量进行主成分分析,如图5 所示,主成分1 和2 的贡献率之和高达88.0%,说明主成分1 和2 能反映绝大部分原始变量的信息。类似地,对3 种番石榴绿熟期的133 种挥发性成分的峰体积进行主成分分析,如图6 所示,主成分1 和2 的贡献率之和高达89.1%,说明主成分1 和2 能反映绝大部分原始变量的信息。从图5 和图6 可知,3 个红肉番石榴品种的挥发性成分差异较大,尤其是‘西瓜红’番石榴与另外2 个番石榴品种的差异最大,而‘红宝石’和‘红珍珠’番石榴的差异相对较少。因此,可以通过GC-IMS 检测番石榴果实挥发性成分来区分3 个红肉品种。
图5 3 种番石榴绿熟期挥发性成分的主成分分析Fig.5 PC analysis of volatile substances in mature green fruits of 3 kinds of guava
图6 3 种番石榴黄熟期挥发性成分的主成分分析Fig.6 PC analysis of volatile substances in mature yellow fruits of 3 kinds of guava
本研究采用GC-IMS 检测了‘西瓜红’、‘红宝石’和‘红珍珠’3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期的挥发性成分。3 种红肉番石榴绿熟期和黄熟期分别检测出121 和133 种挥发性成分,主要为酯类、醛类、醇类和酮类等4 类物质。3 种红肉番石榴中挥发性成分含量最高的是反式-2-丁烯酸乙酯、2-己烯醛、己醛(单体和二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)、(Z)-3-己烯-1-醇(二聚体)、1-戊烯-3-酮(二聚体)、反式-2-戊烯醛(二聚体)等7 种物质。其中,以2-己烯醛、己醛为代表的青草香和以乙酸乙酯、反式-2-丁烯酸乙酯为代表的果香是3 种番石榴果实的主要香气。萜烯类化合物如β-罗勒烯、柠檬烯、γ-松油烯、α-水芹烯、1,8-桉叶素等对3 种红肉番石榴的香气贡献较大。3 种红肉番石榴中“西瓜红”的挥发性成分最为丰富,顺-3-己烯基乙酸酯(二聚体)、乙酸丙酯(二聚体)、 2-甲基-2-丙醇、苄醇、辛醛(二聚体)等是‘西瓜红’的特征挥发性成分。3 个红肉番石榴品种的挥发性成分差异较大,尤其是‘西瓜红’番石榴与另外2 个番石榴品种的差异最大,而‘红宝石’和‘红珍珠’番石榴的差异相对较小。
对44 种主要挥发性成分进行相对定量分析,发现γ-松油烯、1,8-桉叶素(单体)、反式-2-戊烯醛(二聚体)、1-戊烯-3-酮(二聚体)、乙酸乙酯(二聚体)等在3 种番石榴果实后熟过程中均大幅增加,而β-罗勒烯(单体)、甲基庚烯酮等则大幅减少。己醛(二聚体)在‘西瓜红’和‘红宝石’后熟中大幅增加,而在‘红珍珠’后熟中大幅减少。反式-2-丁烯酸乙酯在‘西瓜红’和‘红珍珠’后熟中大幅增加,而在‘红宝石’后熟中大幅减少。2-己烯醛在3 种番石榴绿熟期和黄熟期中的含量差异不大。3 种番石榴果实主要挥发性成分在绿熟期和黄熟期的变化规律,可为鲜食番石榴的品质评价以及加工利用提供参考依据。