PITC 柱前衍生-高效液相色谱法测大米肽中的16 种氨基酸含量

黄 莹，黄 晶，杨 晓，陈 曦，胡武瑶

（中国健康促进基金会抗衰老营养与健康研发中心，湖北武汉 430000）

大米肽是以大米蛋白为原料，经过酶解得到一类含有肽混合物及少量的游离氨基酸、糖类、水分和无机盐等的物质。大米肽具有抑制酪氨酸酶活性[1]、调节免疫力[2]、抗氧化[3]和降血压[4]等功能。大米肽的氨基酸构成模式与人体需求模式基本一致[5]，可以为人体提供所需的各种必需氨基酸。氨基酸分析是研究各种肽类物质构造、特性和营养价值的重要手段[6]。并且，大米肽的活性与其氨基酸的组成和含量紧密相关[7]。因此，分析大米肽中氨基酸的含量，对大米肽的品质评价和开发利用等均具有重要意义。

目前，测定氨基酸的检测方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有液相色谱-串联质谱法和离子色谱-积分脉冲安培法[8]；间接测定法有柱前衍生法和柱后衍生法。其中，使用最为广泛的就是柱后衍生法[9]，是采用氨基酸分析仪测定氨基酸的经典方法，该方法前处理主要是采用酸水解法，但该处理方法时间较长（为22 h 左右），同时仪器设备较为昂贵，仪器的应用主要集中在测定氨基酸的领域[10]；柱前衍生（高效液相色谱法）则无需专一设备，灵敏度高、分析时间短、仪器的适用性更广[11]，被认为是经典氨基酸分析技术的一种替代技术[12]。柱前衍生常用试剂有邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[13]、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate，AQC）[14]，2，4-二硝基氯苯（2,4-Dinitrochlorobenzene，DNCB）[15]和异硫氰酸苯酯（PITC）等[16]。这些衍生试剂中PITC 与氨基酸反应迅速、产物单一稳定、衍生后易除去多余试剂且不会影响检测灵敏度[17]，已被广泛应用于胶原蛋白肽[18]、黄酒[19]、烟草[20]、水果[21]、药物[22]等领域中。目前鲜有关于大米肽中氨基酸含量采用柱前衍生-高效液相色谱法检测的报道，为了证明该方法同样适用于大米肽中氨基酸的检测，并能够同时、快速、高效、稳定的完成16 种氨基酸的检测，因此本文拟建立一种柱前衍生化高效液相色谱法，以PITC 为柱前衍生剂，以期为大米肽的品质评价和开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

16 种氨基酸（天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys））标准混合液、苯酚（分析纯）、异硫氰酸苯酯、三乙胺、三水乙酸钠、乙腈、甲醇、正己烷 其余均为色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司；盐酸、冰醋酸分析纯，国药集团化学试剂有限公司；大米肽样品市售。

MTN-2800D-12 氮吹仪 天津奥特塞恩斯仪器有限公司；Agilent1260 高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC） （ ultraviolet detector，VWD） 美国Agilent 公司；202-2AB 电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；MS3digitial 涡旋振荡器 德国IKA 公司；PE20 型pH 计梅特勒-托利多仪器；AB204-A 分析天平 上海梅特勒-托利多仪器公司；ZORBAXSB-Aq（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱、AthenaAAA（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准溶液配制 分别精密量取16 种氨基酸混合标准溶液2.5 μmol/mL，用0.1 mol/L 的盐酸溶液稀释成1.25、0.5、0.25、0.125 μmol/mL 4 个浓度，2～8 ℃冷藏保存。

1.2.2 样品溶液制备 大米肽样品：称取大米肽样品80.00 mg 放入水解管中，加入含0.1%苯酚6 mol/L盐酸10 mL，将水解管中充入氮气2～3 min 后拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在165 ℃的恒温箱中水解1 h，取出冷却至室温。打开水解管，将水解液转移至100 mL 容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一100 mL 容量瓶内，定容，过滤，除去初滤液后收集剩余滤液。准确吸取1 mL 滤液移入试管中，在60 ℃氮吹条件下吹干，用1 mL 超纯水完全溶解后转移至1.5 mL 离心管中，待衍生备用。

空白样品：除了不加入大米肽样品之外，空白样品的制备和大米肽样品的制备相同。

1.2.3 柱前衍生化 室温条件下，取氨基酸标准混合液或样液200 μL 置于1.5 mL 离心管中，加入0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol/L 三乙胺乙腈溶液100 μL，混匀，室温下放置1 h 后加入400 μL正己烷，漩涡混合器振荡5～10 s，静置10 min。吸取下层溶液200 μL 和800 μL 超纯水混合，过0.45 μm有机滤膜，得样品溶液，待进样。

1.2.4 色谱条件和计算方法 色谱柱：Athena AAA 4.6×250 mm，5 μm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：5 μL；流动相A：甲醇:乙腈:水=20:60:20；流动相B：50 mmol/L 乙酸钠溶液；洗脱程序为：0～38 min：5%流动相A 和95%流动相B、39 min：49%流动相A 和51%流动相B、40～50 min：100%流动相A、51～60 min：5%流动相A 和95%流动相B。

计算公式如下：

As 表示氨基酸s 的含量，%；Xs 表示氨基酸s 的峰面积带入相应曲线后计算出的氨基酸s 的浓度，μmol/mL；Ms 表示氨基酸s 的分子量，g/mol；0.001 表示单位换算系数；m 表示样品的质量，g；V 表示定容体积，L；N 表示浓缩倍数。

1.2.5 方法学考察 从线性关系、专属性实验、精密度实验、重复实验性、稳定性实验和加标回收实验对该方法进行方法学考察。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016 进行数据统计，并利用SPSS 21.0 软件进行显著性分析（P＜0.05），每组实验进行3 次平行，实验结果以平均值表示。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

ZORBAXSB-Aq 色谱柱最适用于增加难以分离的酸性，碱性和极性化合物的保留值，其保留作用比许多传统的C18 HPLC 柱要强，该柱子具有亲水性的表面，及时采用100%的水溶液流动相，也可以有效的防止固定相的塌陷，因此该柱子作为一种实验室常用的HPLC 分离柱。Athena AAA 色谱柱是一种应用于生物发酵液、饲料、氨基酸注射液、食品、饮料中的氨基酸检测的专用柱，具有分离性能优，重现性好，适应性强，稳定性好的特点。

本实验先采用ZORBAXSB-Aq 色谱柱进行氨基酸混合标准品中氨基酸的分离，发现分离效果较差，为了将各个氨基酸完全分离出来，而后采用了Athena AAA 色谱柱进行分离，实验对比结果由图1可以看出，采用Athena AAA 色谱柱的分离效果优于ZORBAXSB-Aq 色谱柱的分离效果：a.分离度高。Athena AAA 色谱柱能将16 种氨基酸完全分离出来，ZORBAXSB-Aq 色谱柱并没有将第13 号和第14 号氨基酸分离出来；b.分离时间快。Athena AAA 色谱柱分离16 种氨基酸在39 min 分钟全部完成，ZORBAXSB-Aq 色谱柱则需要41 min；c.精密度高。两款柱子在分离同一浓度的氨基酸混合标准品时，Athena AAA 色谱柱分离得到各个氨基酸的峰高均高于ZORBAXSB-Aq 色谱柱分离得到的各氨基酸的峰高。因此后续实验采用Athena AAA 色谱柱对大米肽中氨基酸进行分离。

图1 ZORBAXSB-Aq 色谱柱（a）和Athena AAA 色谱柱（b）分离的色谱图Fig.1 Chromatogram of separation between ZORBAXSB-Aq column (a) and Athena AAA column (b)

2.2 线性关系考察

以混合标准液的浓度为横坐标，其衍生物峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，根据信噪比（S/N=3）和（S/N=10）分别确定出检出限（LODs）以及定量限（LOQs）。结果见表1，16 种氨基酸在0.125～2.5 μmol/mL 的范围内的线性关系良好，其中14 种氨基酸的决定系数R2均≥0.9999，另外2 种氨基酸的决定系数R2分别为0.9998 和0.9994，检出限为0.003%～0.018 %，定量限为0.010%～0.059 %，表明仪器灵敏度高，较低质量浓度的氨基酸即可被进行检测。傅博强等[23]采用6-氨基喹啉基-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯柱前衍生-超高效液相色谱测定转基因大米中氨基酸的含量，发现17 种氨基酸标准工作曲线的线性回归决定系数均大于0.999，这与本实验发现大米肽中各氨基酸的线性关系良好相一致，说明采用柱前衍生-高效液相色谱法适合测定大米肽中的氨基酸含量。

表1 16 种氨基酸的线性方程Table 1 Linear equations of 16 amino acids

2.3 专属性实验

取大米肽样品、16 种氨基酸混合标准品和空白样品进样测定。结果空白样品中未出现干扰主峰测定的色谱峰，供试样品与对照样品溶液色谱中，氨基酸峰保留时间一致，各氨基酸间分离度大于1.5。其色谱峰见图2。

图2 供试样品（A）、混合标准品（B）、空白样品（C）色谱图Fig.2 Chromatogram of test sample （A）, mixed standard （B） and blank sample （C）

2.4 精密度试验

精密吸取2.5 μmol/mL 氨基酸混合标准溶液，衍生后连续进样6 次，测定各种氨基酸的峰面积并计算其RSD，结果如表2 所示，16 种氨基酸的RSD均＜5%，表明该仪器精密度良好。

表2 16 种氨基酸的加标回收率Table 2 Recovery rates of 16 amino acids

2.5 重复性试验

取6 份同一大米肽样品80.00 mg 分别放入6 个水解管中，按1.2.2 和1.2.3 进行样品水解和衍生，制备6 份衍生样品进样，测定各种氨基酸的峰面积并计算其RSD，结果如表2 所示，16 种氨基酸的RSD 均＜5%，说明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一大米肽样品80.00 mg，按1.2.2 和1.2.3进行样品水解和衍生，制备1 份衍生样品，在衍生后0、2、4、8、12、24 h 后进样，测定各种氨基酸的峰面积并计算其RSD，结果如表2 所示，16 种氨基酸的RSD 均＜5%，表明衍生样品在衍生后24 h 内稳定性良好。

2.7 加标回收试验

称取同一大米肽样品80.00 mg（已知氨基酸含量）6 份，分别进行水解，其中2 份样品用于样品浓度测定，3 份用于加标回收实验浓度测定。加入2.5、1.25、0.5 μmol/mL 的氨基酸标准混合液，每个浓度分别进行3 次衍生平行。计算平均加标回收率和RSD，结果如表2 所示，结果表明各组分的平均加标回收率为82.21%～103.59%，RSD 均＜5%，说明该方法精密度良好，准确度高。

2.8 样品测定

精密称取5 份不同厂家的大米肽样品，编号为样品1～样品5，采用上述优化方法进行进样测定，16 种氨基酸的含量见表3。从表3 的结果可以看出，5 份大米肽均含有较高含量的Glu 和Asp，其次是Arg 和Leu，这与周侃等[24]的研究结果相似，均为这几种氨基酸含量较高。Glu 是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一[25]，可促进氮基丁酸的合成，从而降低血氮，促进脑细胞呼吸[26]。Asp 具有防止和恢复疲劳的作用[27]。Arg 是维持婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸[28]。Leu 具有抗氧化的作用[29]，这也进一步说明大米肽具有抗疲劳、抗氧化等生物活性离不开这些氨基酸的作用。同时王申等[30]采用柱后衍生高效液相色谱法测定大米中氨基酸的组成，发现大米肽中氨基酸含量最高的也是Glu，其含量为16.1%；其次含量高的也是Asp，为8.44%，与本实验采用柱前衍生-高效液相色谱法测定五种大米肽中最高氨基酸的含量相一致，说明柱前衍生-高效液相色谱法适合测定大米肽中的氨基酸含量。

表3 不同厂家大米肽的氨基酸组成和含量Table 3 Amino acid composition and content of rice peptides from different manufacturers

精密称取某个厂家的大米肽样品2 份，编号为样品6，分别采用传统的国标方法氨基酸分析仪和PITC 柱前衍生-高效液相色谱法测定氨基酸含量，其检测结果如表4 所示。结果发现，16 种氨基酸中，同一种氨基酸分别采用两种方法测定的含量之间无显著性差异，氨基酸分析仪测定的氨基酸总量为80.58%±1.32%，PITC 柱前衍生-高效液相色谱法测定的氨基酸总量为81.62%±1.15%，也无显著性差异，说明柱前衍生-高效液相色谱法适用于测定大米肽中氨基酸的含量，且准确度较高。

表4 不同方法测定大米肽的氨基酸组成和含量Table 4 Determination of amino acid composition and content of rice peptides by different methods

3 结论

本实验构建了PITC 柱前衍生高效液相色谱法测定大米肽中的16 种氨基酸含量的方法，该方法能有效分离16 种氨基酸，各氨基酸组分的线性范围较宽，均在0.125～2.5 µmol/mL 范围内，呈良好的线性关系，14 种氨基酸线性关系的决定系数R2≥0.9999，另外2 种氨基酸的决定系数R2分别为0.9998 和0.9994，检出限为0.003%～0.018%，定量限为0.010%～0.059%，加标回收率在82.21%～103.59%，RSD 均小于5%。说明方法精密度好，准确度高，适用于大米肽的氨基酸含量分析，为后续大米肽的氨基酸含量测定提供理论基础和技术支持。