响应面法优化复合涂膜对刮皮生姜的护色工艺

佟沫儒，李培培，张 伟,2,3,4，俞 浩，吴德玲,2,3,4,*

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012；2.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽合肥 230012；3.安徽中医药大学国家中医药管理局中药炮制传承基地，安徽合肥 230012；4.安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽合肥 230012；5.亳州学院，安徽亳州 236800）

生姜为姜科姜属植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的根茎，作为一种药食同源的作物，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳、解毒的功效[1-2]，主要有挥发油、姜辣素、二苯基庚烷类成分，还含有生姜多糖、糖蛋白及一些微量元素[3-4]。有研究表明生姜具有提高消化酶活性、抑制血小板凝聚、降血脂、抗氧化、防腐抑菌等多方面生物活性[5-8]。生姜具有广阔的市场前景，随着其种植面积的增多和市场对高质量生姜制品需求的增长，生姜的加工及相关产品开发已经成为生姜产业发展的趋势[9-10]。然而新鲜生姜在加工过程（刮皮）中由于受到机械损伤，会产生褐变、失水及组织软化等问题，使营养价值及食用品质降低，如姜辣素、黄酮、总酚含量大幅降低，尤其是褐变问题尤为突出，严重制约了生姜产业的发展[11-12]。

目前为防止新鲜果蔬发生褐变多采用亚硫酸盐类化学护色剂、防腐剂[13]及柠檬酸[14]、抗坏血酸[15]、1-甲基环丙烯[16]等化学护色剂进行护色，但这些化学护色剂的使用条件和浓度要求高，还可能损害果蔬品质，存在食品安全隐患[17]。出于经济成本、安全性、消费者接受度等方面的原因，目前可食性涂膜的应用日益增多[18]。可食性涂膜是以天然可食性物质（如多糖、蛋白质、脂类等）为原料，通过不同分子间相互作用，并以包裹、涂布、微胶囊等形式覆盖于果蔬表面，以阻隔水气、氧气或各种溶质的渗透，起保护作用的薄层，进而达到抑制果蔬褐变的效果[19-20]。壳聚糖作为果蔬护色剂已广泛应用于日常水果的护色，而且性能稳定，安全无毒，得到了行业的高度认可[21-22]。海藻酸钠是从褐藻类海带或马尾藻中提取的天然多糖，是多羟基、多极性高分子化合物，可生物降解，生物相容性好[23-24]。卡拉胶可作防腐剂载体，能显著地降低食品中水分的损失，对氧气有一定的阻隔作用，既可将食品与外界环境隔开，同时也保证了食品质量[25]。但单一涂膜存在成膜性能不够好、机械性能较弱[26]和果蔬失重率变化较大[27]等缺陷，复合涂膜剂则弥补了这些缺点，可通过各组分间的功能互补和特定的配比组合，提高护色效果[28]。马利华等[29]发现壳聚糖、卡拉胶、海藻酸钠组成复合涂膜可明显降低山药的褐变程度，防止贮藏后期酚类物质的氧化，进而提高鲜切山药的整体抗氧化能力，说明复合涂膜不仅有很好的护色效果，还可保持果蔬抗氧化能力。有研究表明生姜刮皮后暴露在空气中与氧气接触是发生褐变的重要原因之一[12]，可通过可食性涂膜天然无毒、可隔绝氧气等特点对生姜进行护色。而目前关于生姜的护色研究主要通过复合化学抑制剂[30]、化学护色剂结合可食性涂膜[31]、单一涂膜剂[32]等方式进行护色，未在复合可食性涂膜方面形成完整的护色工艺。

综上所述，为抑制生姜在加工过程中发生褐变并且不损害生姜品质，本研究以刮皮生姜为原料，运用响应面法优化抑制刮皮生姜褐变的复合涂膜护色工艺参数，筛选出最佳护色方法，形成稳定可靠的刮皮生姜防褐变的复合可食性涂膜护色技术，为抑制生姜在加工过程中发生褐变、提高生姜产品的商业价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生姜 购自菜市场，选取大小一致、表皮完整，无机械损伤及病害的新鲜生姜，储藏存放地点：安徽中医药大学中药与天然药物系；壳聚糖、海藻酸钠、卡拉胶、没食子酸标准品（≥98%）、硝酸铝、亚硝酸钠 均购自上海麦克林生化科技有限公司；福林酚购自西亚化学有限公司；芦丁标准品（≥98%） 购自北京百灵威科技有限公司；香草醛标准品（99.5%）购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠 购自成都市科隆化学品有限公司；DPPH 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯；水为去离子水。

JY2003 型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-8000 型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；H1750R 型冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH 数显恒温水浴锅常州国宇仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 涂膜剂的制备 壳聚糖涂膜剂的配制：准确称量一定量的壳聚糖，加入60 ℃蒸馏水中，配成浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%壳聚糖溶液。

海藻酸钠涂膜剂的配制：准确称量一定量的海藻酸钠，加入60 ℃蒸馏水中，配成浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%海藻酸钠溶液。

卡拉胶涂膜剂的配制：准确称量一定量的卡拉胶，加入40 ℃蒸馏水中，配成浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%卡拉胶溶液。

1.2.2 护色工艺的优化

1.2.2.1 涂膜剂处理刮皮生姜的单因素实验 选取刮皮生姜作为试验材料，将其清洗，刮皮，并进行分组，分别整块浸泡于配制好的上述单一护色涂膜溶液中10 min，以浸泡蒸馏水10 min 的刮皮生姜为空白对照组；取出自然晾干，4 ℃贮藏15 d（对照组已经开始腐烂），每5 d 测定各组刮皮生姜的失重率、褐变度及总酚含量。

1.2.2.2 Box-Beheken 优化试验 在单因素实验的基础上，以卡拉胶浓度、壳聚糖浓度、海藻酸钠浓度为研究因素，根据Box-Behnken 中心组合设计原理设计三因素三水平实验，以刮皮生姜以刮皮生姜护色最主要的褐变度为衡量指标，以期得到最佳护色效果，其响应面试验设计见表1。

表1 Box-Beheken 试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Beheken test

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 失重率测定 采用称重法[33-34]，先用电子天平称新鲜刮皮生姜，4 ℃储藏每隔5 d 测定一次生姜重量，重复三次。计算方法如下：

式中：m0表示刮皮生姜初始重量，mg；m 表示刮皮生姜定期测量的重量，mg。

1.2.3.2 褐变度测定 采用吸光值法[30,34]。将生姜样品洗净，刮皮切片，称取5.0 g 生姜加入50 mL 蒸馏水，于低温4 ℃下匀浆2 min，4000 r/min 条件下离心5 min，在波长420 nm 处测定上清液的吸光值，褐变度结果以A420表示，每隔5 d 测定一次。数值越小，褐变度越低。

1.2.3.3 总酚含量测定 采用林倩等[35]的方法进行测定。取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mL 浓度为0.1 mg/mL 的没食子酸标准溶液置于25 mL 容量瓶中，分别加入4.5 mL 福林酚试剂，混匀，静置30 s，再分别加入9 mL 10% Na2CO3定容至25 mL，避光放置2 h，以0 样为空白，在760 nm 波长下测吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线线性方程为：y=0.1573x-0.0013，R2=0.9994。

再取5 g 刮皮生姜，冰浴研磨，用60%乙醇溶解，50 mL 容量瓶定容，提取2 h，过滤，取滤液10 mL，定容至25 mL 备用。取1 mL 处理液至25 mL 容量瓶中，其它步骤同标准曲线建立。

1.2.3.4 总黄酮含量测定 参照贾茹羽[12]的方法进行测定。准确称取芦丁标准品20 mg，以1:25 的料液比加入80%乙醇溶液，在超声功率300 W 条件下超声溶解1 h，再转移到50 mL 容量瓶中，并定容后得质量浓度0.4 mg/mL 的芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 容量瓶中，分别加入1 mL 5%的NaNO2溶液，1 mL 10%的Al（NO3）3溶液和10 mL 4% NaOH溶液，加溶液之前摇匀振荡6 min，最后加入80%乙醇溶液定容，静置20 min 后测定吸光值。所得标准曲线线性方程为：y=6.3542x+0.0292，R2=0.9991。

再准确称取1 g 样品，以1:25 的料液比加入80%乙醇溶液，在超声功率300 W 频率条件下超声提取1 h，定容至50 mL。吸取1 mL 80%的乙醇，1 mL 上述提取液于25 mL 棕色容量瓶中分别加入1 mL 5%的NaNO2溶液，1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，10 mL 4%的NaOH 溶液，加溶液之前摇匀振荡6 min，最后加入80%乙醇溶液定容，静置20 min 后定吸光值。代入标准曲线计算生姜黄酮的含量。

1.2.3.5 姜辣素含量测定 参照贾茹羽[12]的方法测定。在0.0500 g 香草醛标准品中，加入适量95%乙醇溶液并定容至25 mL，吸取上述溶液1 mL 再加入适量95%乙醇溶液定容至100 mL，得到20.00 μg/mL浓度的香草醛标准液。分别吸取上述标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入适量95%乙醇溶液来定容，得到2、4、6、8、10、12 μg/mL 浓度的系列标准液，以95%乙醇作为空白对照，于280 nm 下测定吸光值。所得标准曲线线性方程为：y=0.0608x+0.0223，R2=0.9993。

再准确称取1 g 样品于100 mL 圆底烧瓶中，加入70 mL 95%的乙醇，在65 ℃水浴提取120 min，静置冷却，定容，过滤，得到姜辣素样品。吸取1 mL样品于50 mL 容量瓶中，加入适量95%乙醇溶液定容，混匀。以95%乙醇为空白对照，于280 nm 处测定吸光值，代入标准曲线中计算姜辣素的含量。

1.2.3.6 DPPH 自由基清除率实验 采用DPPH 自由基清除能力检测试剂盒，按照试剂盒说明书方法测定样品的DPPH 自由基清除能力。

1.3 数据处理

单因素实验数据采用Graphpad Prism 8.0 对数据进行单因素方差分析及作图测定结果以平均值±标准差（n=3）表示；响应面试验数据用Design-Expert 11.0 软件进行响应面试验分析。

2 结果与分析

2.1 单一涂膜剂护色效果

2.1.1 不同浓度壳聚糖对失重率、褐变度及总酚含量的影响 生姜的失重率是评价护色剂保鲜效果最直观的指标[35]；褐变度反映果蔬颜色的变化，是食品的重要品质指标[12]；总酚为酚类物质，是果蔬组织褐变发生的基础物质，并且其含量可以反映果蔬的抗氧化活性[36]。由图1 可以分析得出，随着贮藏时间的延长，不同浓度壳聚糖处理的生姜失重率、褐变度整体均呈上升趋势，而总酚的含量呈下降趋势。且处理组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。由图1a～图1b可以看出，浓度为1.6%和2.0%壳聚糖处理下的刮皮生姜的失重率、褐变度较低（P＜0.05）。图1c 中可以看出，刮皮生姜中总酚的含量降低得愈加缓慢，且当浓度为1.6%和2.0%时，总酚含量降低得最慢。综合分析效果最佳的壳聚糖浓度为1.6%、2.0%，故最终选用浓度为1.2%～2.0%壳聚糖进行响应面试验。

图1 不同浓度壳聚糖对失重率、褐变度及总酚含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of chitosan on weight loss, browning and total phenolic content

2.1.2 不同浓度海藻酸钠对失重率、褐变度及总酚含量的影响 由图2 可以分析得出，随着贮藏时间的延长，不同浓度海藻酸钠处理的生姜失重率、褐变度整体均呈上升趋势，而总酚的含量呈下降趋势，且处理组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。由图2a～图2b可以看出，浓度为2.0%海藻酸钠处理下的刮皮生姜的失重率、褐变度最低（P＜0.05）。图2c 中可以看出，刮皮生姜中总酚的含量降低得愈加缓慢，且当浓度为2.0%时，总酚含量降低得最慢。综合分析效果最佳的海藻酸钠浓度为2.0%，故最终选用浓度为1.6%～2.0%海藻酸钠进行响应面试验。

图2 不同浓度海藻酸钠对失重率、褐变度及总酚含量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of sodium alginate on weight loss, browning and total phenolic content

2.1.3 不同浓度卡拉胶对失重率、褐变度及总酚含量的影响 由图3 可以分析得出，随着贮藏时间的延长，不同浓度卡拉胶处理的生姜失重率、褐变度整体均呈上升趋势，而总酚的含量呈下降趋势，且处理组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。由图3a～图3b可以看出，浓度为1.2%、1.6%、2.0%卡拉胶处理下的刮皮生姜的失重率、褐变度较低（P＜0.05）。图3c中可以看出，刮皮生姜中总酚的含量降低得愈加缓慢，且当浓度为2.0%时，总酚含量降低得较慢。综合分析效果最佳的卡拉胶浓度为1.2%、1.6%、2.0%，故最终选用浓度为1.2%～2.0%海藻酸钠进行响应面试验。

图3 不同浓度卡拉胶对失重率、褐变度及总酚含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of carrageenan on weight loss, browning and total phenolic content

2.2 复合涂膜剂对生姜的护色效果

2.2.1 响应面试验设计结果 根据单因素实验结果，以壳聚糖浓度、海藻酸钠浓度、卡拉胶浓度作为自变量，褐变度为响应值，利用 Design-Expert 11.0 软件设计三因素三水平的响应面试验，响应面的试验设计和结果如表2 所示。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 模型与方差分析结果 用Design-Expert 11.0软件对试验数据方差分析，结果如表3 所示。

表3 模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance table

根据表3 中的数据对试验结果回归拟合，得到回归模型方程为：Y=0.2776+0.0706A+0.0537B+0.0431C-0.0560AB+0.0168AC-0.865BC+0.0886A2+0.1328B2+0.0566C2。模型的P值为0.0001，说明建立的回归模型显著；所建立回归模型的决定系数R2为0.9711，说明生姜褐变度的实测值与预测值拟合较好，可用此模型来预测不同浓度的壳聚糖、海藻酸钠、卡拉胶对新鲜生姜褐变度的影响；失拟项P=0.7998＞0.05，失拟项不显著，无失拟因素存在。各因素对响应值的影响可通过方差分析中的F值评价，F值越大，说明对响应值的影响越显著，所以各涂膜对鲜生姜褐变度的影响顺序为：壳聚糖＞海藻酸钠＞卡拉胶。

2.2.3 各因素交互作用分析 采用Design-Expert 11.0 软件对试验结果进行多元回归分析，得到护色剂壳聚糖浓度（A）、海藻酸钠浓度（B）、卡拉胶浓度（C）对刮皮生姜褐变度交互影响的响应曲面，如图4所示。

图4 各因素交互对生姜褐变影响的响应面图Fig.4 Response surface graph of the interaction of various factors on ginger browning

图4 所示的响应面图的陡峭程度可以反映出两个因素的交互作用对响应值影响的显著性，响应面图越陡峭则表明两个因素的交互作用越显著[37]。由图4a 可知，A 轴与B 轴的曲线坡度的变化程度大，说明壳聚糖和海藻酸钠的交互作用显著。由图4b可知A 轴的曲线坡度与C 轴的曲线坡度的变化程度较小，说明壳聚糖和卡拉胶交互作用不显著。由图4c 可知，B 轴的曲线坡度与C 轴的曲线坡度的变化程度大，海藻酸钠和卡拉胶交互作用显著。上述结果与方差分析结果一致：三因素对响应值影响大小顺序为：壳聚糖浓度＞海藻酸钠浓度＞卡拉胶浓度，海藻酸钠与卡拉胶的交互作用最为显著。

2.2.4 复合涂膜剂配方的确定及验证试验 据试验得到的响应面数据，对上述多元回归拟合方程用Design-Expert 11.0 软件进行复合涂膜的最优值预测，得出三种护色剂最佳配方为壳聚糖为1.399%，海藻酸钠为1.783%，卡拉胶为1.311%，在此条件下预测褐变度为0.230。对该优化条件进行验证实验，平行3 次，该条件下新鲜刮皮生姜的褐变度为0.232，接近理论值，证明该模型可行。结果表明复合涂膜护色剂可有效抑制生姜刮皮后发生褐变，保持生姜有良好的色泽，且采用响应面分析法优化得到的工艺参数准确可靠有较强的实用价值。

2.3 护色工艺对刮皮生姜品质的影响

将护色处理后的刮皮生姜进行各项品质指标测定，探究该护色工艺对生姜的外观品质和营养品质的影响。由表4 可知，护色处理组的褐变度及失重率与对照组呈显著差异（P＜0.05），褐变度变化值较低。与王兆升等[32]、贾茹羽[12]、丁君等[31]的研究结果相比，本研究的复合涂膜通过阻隔水气、氧气或各种溶质的渗透，起保护作用的薄层，使处理后生姜褐变度及失重率变化值低，进而达到抑制刮皮生姜褐变的效果，显著地降低其水分的损失，同时总酚含量、姜辣素含量及总黄酮含量均显著高于未进行护色处理的生姜（P＜0.05），可在一定程度抑制品质成分含量的损失，并且护色处理组DPPH 自由基清除能力高于对照组（P＜0.05），说明复合涂膜可有效保留生姜的抗氧化能力。与白琳等[37]、张璇等[38]、贾茹羽[12]结果相比，由于涂膜剂各组分间的功能互补和特定的配比组合有效防止贮藏后期酚类物质的氧化，进而提高刮皮生姜的整体抗氧化能力。

表4 护色处理后储藏15d 生姜的品质指标Table 4 Quality indicators of ginger stored for 15 d after color protection treatment

3 结论

本文以刮皮生姜为原料，在单因素实验基础上，对壳聚糖-海藻酸钠-卡拉胶复合护色工艺进行了响应面优化，得到最佳复合涂膜护色配方为1.399%壳聚糖、1.783%海藻酸钠、1.311%卡拉胶。在该护色条件下刮皮生姜储藏15 d 的褐变度为0.232，相比对照组降低了53%，说明该护色工艺可有效抑制生姜褐变，保护生姜色泽；测得姜辣素含量为1.62%，总黄酮含量1.83%，总酚含量53.88 μg/g，失重率0.89%，DPPH 自由基清除能力为442.21 μg Trolox/g，均与对照组有显著性差异（P＜0.05），说明该护色工艺可在一定程度上保留刮皮生姜在储藏期间的外观品质和营养品质。并且工艺简单、生产成本低、绿色安全无污染、所得产品实用方便。可为刮皮生姜的复合涂膜剂提供数据可供参考，对促进生姜的工业化生产具有理论和现实意义。