沙库巴曲缬沙坦钠通过Bax/caspase-3信号通路抑制心肌细胞凋亡

李亚芹,刘毅,王潇伟,崔红根,康世鑫,徐占稳

(河北大学附属医院 心血管内科,河北 保定 071000)

心力衰竭是各种心脏疾病发展到严重阶段或晚期的一种临床综合征,心衰患者由于需要反复住院,增加了患者及社会的经济负担,严重影响患者的生活质量和寿命.如何提高患者生活质量,延缓心衰的进展是心衰治疗的关键问题.心力衰竭的病理基础是各种原因导致的心室重构,发生机制为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和交感神经系统(SNS)的长期过度激活,同时炎症因子的过度分泌以及心肌细胞凋亡数量增加是加重心衰的主要原因[1].沙库巴曲缬沙坦钠(LCZ696)是由血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂及脑啡肽酶抑制剂前体以 1∶1 (物质的量比)组成,两者协同发挥作用,明显降低心衰住院率[2-3],LCZ696于 2015 年 7 月获美国 FDA 批准上市,2018年应用于中国,目前对LCZ696的研究多为临床上改善心衰症状方面,对其抑制心室重构的分子机制尚不明确,基于此,本研究通过给予心衰大鼠LCZ696治疗,与缬沙坦对比,观察对心衰大鼠心功能及心脏结构的影响,探讨其改善心室重构、治疗心衰的作用机制,为其临床应用提供新的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性sprague dawley(SD) 大鼠30 只,6 周龄,SPF级,体质量200 g左右,由北京斯贝福生物科技有限公司提供【合格证号SCXK(京)2019-0010】,饲养在河北大学医学实验动物中心SPF级动物室,适应性饲养2周后进行实验,严格遵守实验动物保护条例,实验操作均已经过河北大学动物伦理委员会的批准.

1.2 材料与仪器

注射用盐酸阿霉素(10 mg/支)(深圳万乐药业有限公司);沙库巴曲缬沙坦钠(100 mg/片)(诺华制药);缬沙坦(80 mg/片)(诺华制药);BNP ELISA 试剂盒(江苏晶美生物科技公司);RIPA裂解液(北京索来宝公司);一抗Bax(武汉三鹰公司);Cleaved-caspase-3(英国Affinity公司);内参(中杉金桥公司);二抗Bax(中杉金桥公司);PVDF膜(法国Millipore公司);X射线胶片(加拿大Carestream公司);蛋白浓度定量仪(德国Eppendorf公司);电泳仪(北京君意公司);石蜡切片机(德国Leica公司);光学显微镜(日本OlymPus公司);COBAS6000型全自动生化仪(德国罗氏诊断公司);小动物超声仪(飞利浦公司);无创血压检测仪(美国Kent公司).

1.3 动物模型的构建及实验分组

6周龄的SD大鼠30只,首先在动物房适应性喂养2 周,然后随机取5只做为空白组(Control),另外25只用于构建心衰模型:将盐酸阿霉素用生理盐水配成1.0 mg/mL的溶液,大鼠称体质量,按总剂量15.0 mg/kg,将盐酸阿霉素溶液分6次进行大鼠腹腔注射,每周2次,共3周.Control组大鼠注射等量的生理盐水.给药期间观察大鼠进食活动情况及死亡情况,末次给药2周后,用小动物超声仪对大鼠进行心脏超声检查,评估Control组和心衰模型组大鼠的心功能和结构情况,结果显示:20只大鼠左室舒张末内径(LVEDD)显著高于Control组,短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)显著低于对照组(P<0.05),模型构建成功[4-6],另外3只未达此标准,死亡2只.将建模成功的20只大鼠随机分为心衰组(HF)、缬沙坦组(Val)和LCZ696低剂量组(LCZ-L)、LCZ696高剂量组(LCZ-H),每组 5 只.Control组大鼠给予生理盐水灌胃(2 mL/次,2次/日),Val组(按标准服用方法)以8.4 mg/kg溶于 2 mL 生理盐水中灌胃(1次/d); LCZ-L组、LCZ-H组使用LCZ696分别按10 mg/kg和20 mg /kg溶于 2 mL 生理盐水中灌胃( 2 次/d),给药8周后检测相关指标.

1.4 大鼠体质量、进食及活动情况的监测及观察

每周称量大鼠体质量,同时观察各组大鼠进食及活动情况.

1.5 大鼠血压及心脏功能的检测

分别在药物灌胃治疗后第2、4、6、8周运用无创尾套动脉血压测试法测量血压:首先加热测试箱的温度至35 ℃,然后对尾部加热 5～10 min后,固定脉搏换能器,实验对象安静后,打开脉搏换能器,等待脉搏波的出现并稳定后开始测试,每次测试间隔 2 min,每只大鼠测6～8次,取平均值.通过配套软件在电脑上获取收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)及心率(HR)数据.

药物灌胃治疗8周后用小动物超声仪对大鼠心脏功能进行检查.首先用10 g/L戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位将大鼠固定于超声检测板上,将大鼠心前区毛发脱净,使用M 型超声探头连续测量5 个心动周期.记录各组大鼠LVEDD、LVEF、FS数值.

1.6 血清生化指标分析

大鼠麻醉后眼球取血,离心取血清,全自动生化仪检测血清中CK-MB、CK、谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST)的含量;ELISA法检测大鼠血清BNP水平(按检测试剂盒说明书步骤进行).

1.7 心脏外观、心脏质量指数和心肌HE染色、心肌细胞Tunel染色

处死大鼠,取出心脏,分离后称其质量,计算心脏质量指数(心脏质量/大鼠体质量),并进行各组心脏标本比较;取大鼠左心室部位心肌组织,经福尔马林溶液固定、石蜡包埋后切片,常规HE染色后,显微镜下观察组织病理及纤维化程度.将各组大鼠心肌细胞进行Tunel染色,观察心肌细胞凋亡情况.

1.8 Western blot 检测大鼠心肌组织凋亡相关蛋白的表达情况

将大鼠麻醉后处死,迅速取出心脏,取左心室心肌组织处理后过夜裂解,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取上清液备用,测定蛋白浓度,制备SDS-PAGE凝胶,根据蛋白定量结果,加入缓冲液,轻轻混合,95 ℃变性10 min后进行电泳,凝胶电泳结束后,将凝胶上分离到的蛋白条带转印至固相支持物上,然后分别用一抗及二抗对其进行孵育、检测,用PBST 洗膜3次,洗去游离二抗,混合液均匀铺在PVDF膜表面,适当曝光,经显影定影液显色,然后进行二次曝光,将胶片扫描后,用Tanon Gis软件测定条带灰度值.

1.9 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行数据处理,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,组间均采用单因素方差分析进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 小动物超声检测大鼠心功能的变化

喂养过程中LCZ-H组及HF组大鼠分别死亡1只.

药物灌胃治疗8周后实验结束,随即进行小动物超声检测:与Control组相比,HF组大鼠左心功能指标LVEDD增加,有统计学意义(P<0.05),LVEF及FS显著降低,有统计学意义(P<0.05);与HF组大鼠相比,Val组及LCZ-L组LVEDD下降,但无统计学意义,LCZ-H组LVEDD下降,有统计学意义;与HF组相比,Val组、LCZ-L组、LCZ-H组LVEF升高,有统计学意义;与HF组相比,Val组 FS升高,但无统计学意义,LCZ-L组、LCZ-H组FS升高,有统计学意义,结果见图 1.

与Control组比较,*P<0.05; 与HF组比较,#P<0.05,##P< 0.01图1 大鼠心脏功能指标的超声结果Fig.1 Ultrasound results of cardiac function indicators in rats

2.2 大鼠体质量、平均动脉血压、心率的变化

与Control相比,HF组大鼠体质量下降,HR显著升高,MAP下降,这些数据均有统计学意义(P<0.05).治疗后,与HF组相比,Val组及LCZ-L组 MAP变化无统计学意义,HR有所下降,大鼠体质量增加,但均无显著性统计学意义(P>0.05),与HF组相比,LCZ-H组 MAP 有所升高,但无统计学意义(P>0.05),HR明显下降,有统计学意义(P<0.05);与HF大鼠相比,LCZ-L、LCZ-H组体质量有所增加,无统计学意义(P>0.05) (图2).

与Control组比较,*P<0.05; 与HF组比较,#P<0.05图2 大鼠平均动脉压、体质量及心率变化Fig.2 Changes of MAP、weight and HR in rats

2.3 大鼠血清生化指标及BNP、CK-MB的变化

Control组血清中CK-MB、CK、ALT、AST、BNP的含量均低于HF组,有统计学意义(P<0.05),与HF相比,Val组和LCZ-L、LCZ-H组上述各指标均下降,均有统计学意义(P<0.05).其中LCZ-H组降低最明显(P<0.01),Val组与LCZ-L组之间上述指标数值无明显的统计学意义(P>0.05)(图3).

比如按国家计划，某部委安排某央企从事一项业务，但该业务在国资委确定的企业主业以外，这个央企该不该做？重大事件发生时，国家责令某交通企业派飞机执行任务，但这影响企业经济效益，国资委年底考核时企业分数下降，企业该怎么办？类似的矛盾几乎每年都发生。还有一些冲突，原因是国资委本身的角色上它既是企业股东大会，又是国家任命来监管企业的行政机关。比如派遣工，股东大会为央企着想，当然是各类成本越低越好，派遣工肯定能降低人力成本啊，但问题要是提上国家议事日程，国资委得摇身一变，成为负责解决问题的主管部门。

与Control组比较,*P<0.05;与HF组比较,#P<0.05,##P<0.01图3 大鼠血清生化指标的变化Fig.3 Changes of serum biochemical parameters in rats

2.4 大鼠心肌组织HE病理分析结果

大鼠心肌组织HE染色,细胞核为蓝色,细胞质、纤维结缔组织为粉红色;Control组大鼠心肌细胞排列整齐;HF组大鼠心肌细胞破坏,细胞核排列紊乱、大小不一,大量心肌细胞被破坏,可见较多胶原纤维增生;Val组大鼠心肌组织排列较HF组稍显规整,其间伴少量胶原纤维组织增生;LCZ-L、LCZ-H组心肌细胞排列规整,胶原纤维组织明显减少,且LCZ-H胶原纤维增生较LCZ-L有所减轻(图4).

图4 大鼠心肌损伤的组织病理学分析(400×)Fig.4 Histopathological analysis of myocardial injury in rats(400×)

2.5 大鼠心肌细胞Tunel染色观察

正常心肌细胞核呈蓝黑色,凋亡细胞核呈绿色荧光,可见Control组心肌凋亡细胞罕见,与Control组相比,HF组大鼠心肌细胞凋亡数量明显增加,治疗后,Val组和LCZ-L、LCZ-H组心肌细胞凋亡数量较HF组减少,且LCZ-L、LCZ-H组减少程度较Val组明显,LCZ-H组最明显,400倍显微镜下随机取5个视野,计数细胞总数及凋亡细胞数(图5).凋亡指数=(凋亡细胞数/细胞总数)×100% .

与HF组比较,****P<0.001;与Val组比较,###P<0.005图5 心肌细胞凋亡分析(400×)Fig.5 Analysis of myocardial cell apoptosis(400×)

2.6 Western blot 法检测大鼠心肌组织蛋白物质的表达

图6结果显示,与Control组相比,HF组大鼠心肌组织 Bax、caspase-3 水平显著升高,有统计学意义(P<0.05),P-AKT下降,有统计学意义; 与HF相比,Val组Bax、caspase-3 水平降低,有统计学意义(P<0.05) ,P-AKT升高,有统计学意义; LCZ-L、LCZ-H组Bax、caspase-3水平明显降低(P<0.05) ,其中LCZ-H组下降更明显(P<0.01),P-AKT明显升高,有统计学意义(P<0.01).

3 讨论

心肌细胞在长期高血压、冠心病、糖尿病等疾病的影响下可逐渐出现细胞损伤、肥大、凋亡,导致心脏扩大、肥厚等心室重构,最终引起心衰,其发生机制为氧化应激、炎症因子激活等引发的心肌细胞损伤及心室重构[7- 9],故心衰的治疗可通过抑制氧化应激、炎症因子释放和阻断神经内分泌来保护心肌细胞,改善心脏功能.心衰发生时心肌细胞凋亡增加,而凋亡可由炎症反应诱发.使用盐酸阿霉素注射构建慢性心衰大鼠模型,大鼠心肌组织中炎症因子表达升高,心肌细胞凋亡加重,故抑制炎症反应及细胞凋亡可改善心肌重构[10].

心肌细胞凋亡与心肌肥厚、心肌梗死和心衰密切相关,心肌细胞凋亡途径有外源性凋亡途径、内源性凋亡途径(线粒体凋亡途径)、内质网应激凋亡途径;盐酸阿霉素等化学药物可造成细胞内DNA损伤激活凋亡的线粒体通路,线粒体主要通过向细胞质释放能够激活caspase的蛋白来促进细胞凋亡的发生.Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡程序的关键调节组分,存在于线粒体和内质网,由抑制蛋白、促凋亡蛋白(Bax)和死亡效应因子组成,正常情况下线粒体及内质网中抑制蛋白与Bax结合,可抑制Bax的促细胞凋亡活性,而Bax被激活,可引发线粒体释放caspase前体蛋白参与细胞凋亡过程,因此,抑制Bax基因活化是治疗心衰的策略之一[10-12].caspase是一类在凋亡过程中起关键作用的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,在细胞凋亡过程中,Bax增强表达,可损伤线粒体,进而激活caspase-3.Okada 等[13]研究表明:caspase-3 被认为是凋亡通路下游的关键水解酶,一旦caspase-3 被激活,凋亡将不可避免[14].在细胞凋亡过程中,Bax依赖的线粒体通透性受到蛋白激酶AKT的影响[15];AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,也被称为蛋白激酶B,它调节心肌细胞生长、心肌血管生成、葡萄糖代谢和细胞死亡[16].AKT可直接抑制促凋亡蛋白caspase-3的活性,从而促进细胞存活,AKT的短期激活可促进生理肥大和对心肌损伤的保护[17];激活的AKT(P-AKT)可以促进细胞增殖、存活和/或代谢,同时抑制细胞凋亡[18-19].在心衰发生时,Bax的激活可诱导线粒体释放caspase前体蛋白,参与细胞凋亡.因此,抑制Bax基因的激活是治疗心衰的靶点之一.

LCZ696通过抑制心室重构从而治疗心衰,作用确切,但其对心肌细胞凋亡途径的影响尚不明确.本研究对盐酸阿霉素诱发的心衰大鼠给予LCZ696治疗,同时设HF组及Val组进行对照研究,8周后检测各组大鼠心室肌组织中AKT、Bax、caspase-3的水平,结果显示Val组及LCZ-L、LCZ-H组大鼠心肌组织中Bax、caspase-3的水平明显下降,P-AKT水平较HF组升高,均有统计学意义,其中LCZ-H组下降最明显;心肌细胞凋亡进行Tunel染色后显示凋亡细胞数量减少,心功能改善,得出结论,LCZ696通过抑制Bax/caspase-3通路抑制心肌细胞凋亡,改善心肌纤维化,延缓心衰的进展.