阔叶十大功劳作用于AURKA调控铁死亡干预肝癌的作用

李军,杨凯平,林登梅,朱燚,张楠楠

(1.贵州中医药大学 基础医学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州中医药大学 药学院,贵州 贵阳 550025)

癌症在全球成为人类首要死因,根据预测,到2040年全球每年将有2 750万的新发癌症病例[1].中国肝癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)的发病人数约占全球55%,发展迅速,病死率高,侵袭性及转移性强,5年生存率低于15%,预后极差.随着中医药研究的进展,中药抗肿瘤的高效低毒特点正在逐步显现.铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性的,区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式.研究发现铁死亡与多种疾病的发生密切相关[2],更为重要的是铁死亡与肿瘤细胞生长抑制密切相关[3].因此,探索药物是否可调控铁死亡对于肝癌的研究具有重要意义.

中医药治疗恶性肿瘤的研究已日渐成熟,中药具有多靶点、低副作用的特点.阔叶十大功劳Mahoniabealei又叫土黄连、老虎刺、刺黄连,为小檗科植物.阔叶十大功劳的叶、根是贵州苗族常用药[4],具有清热燥湿、泻火解毒、滋阴益肺、兼补肝肾之效[5].现代药理学研究表明:M.bealei中所含化学成分主要为生物碱类、挥发油及黄酮类等,其水提物、醇提物多具有抗菌消炎、抗氧化、扩张血管、抑菌和保肝等作用[6-7].有关研究报道其活性成分可能参与调节炎症因子、氧化应激而对抗肝损伤[8],M.bealei相关组方已被证明可以治疗肝癌[9].但是天然M.bealei在防治肝癌中的作用未见明确报道,且具体的作用靶点和机制尚未完全阐明,仍待进一步研究.

综上,本研究拟运用网络药理学和生物信息学的方法,系统地探索M.bealei通过调控铁死亡基因表达干预肝癌的作用机制,并进行实验验证,以期为M.bealei抗肝癌的作用机制研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞与器材

SPF级SD大鼠,雌雄各半,体质量180～200 g,20只,购自长沙市天勤生物技术有限公司,合格证号:SCXK(湘)2019—0014;人肝癌 HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库,编号SCSP-510;AURKA(Bioswamp,PAB33212);β-actin(景杰生物,PTM-5028);二抗(Gioworld,BS13278);显影剂(Millipore,WBKLS0100);SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(Solarbio,P1200-2);免疫蛋白印迹检测分析系统(美国Bio-Rad公司,BIO-RAD Chemidoc Touch);倒置荧光显微镜(日本Olympus公司,Olympus IX71).

1.2 实验药物

M.bealei木打成粉,用体积分数54%的乙醇,按照液料比(mL/g)13∶1混合超声35 min进行提取,获得M.bealei提取液,浓缩待用(生药质量浓度4 g/mL).

1.3 M.bealei含药血清制备

对照组给予生理盐水灌胃,实验组给予M.bealei提取液灌胃,给药剂量为1.5 g/kg,每天2次,连续灌胃7 d,末次给药2 h后用质量分数1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用腹主动脉取血法取血,4 ℃冰箱静置2 h后离心,取上清液置于56 ℃水浴锅中灭活30 min,0.22 μm滤膜除菌,超净台分装,-20 ℃冰箱保存备用.

1.4 M.bealei成分、靶点筛选

从TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SymMap(http://www.symmap.org/)检索“十大功劳”药物成分、靶点.使用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将药物靶点名称进行转换.在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载化合物的SMILES结构,输入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库获取药物靶点,将药物靶点合并,并删除重复项.

1.5 肝癌差异基因筛选

从GEO(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)数据库获取人的肝癌数据集GSE45267(肝癌组织46例,癌旁组织41例)并通过GEO2R在线工具分析芯片数据,以P<0.05,|logFC|>1 为筛选条件,获得差异表达基因.

1.6 铁死亡基因的收集

从FerrDb 数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/legacy/index.html)下载铁死亡相关基因(包含标记基因、驱动基因、抑制基因)[10].

1.7 药物-疾病-成分-交集靶点网络构建

将从方法1.4～1.6获取的药物、成分、交集靶点一一对应,利用Cytoscape3.9.0软件构建药物-疾病-成分-交集靶点网络.

1.8 基因相关性分析

使用GeneMANIA数据库(http://www.genemania.org)构建关键基因的相互作用网络图.

1.9 分子对接

为了评价药物与潜在靶蛋白之间的相互作用,将选择的关键基因对应的蛋白通过DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1[11]进行高精度对接以评估蛋白-配体的亲和力.有效成分的分子式来源于PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库.目的蛋白的结构文件从PDB数据库[12](http://www.pdb.org/)获取.

1.10 基因差异表达分析

使用GEPIA在线工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)确定关键基因在LIHC患者中表达的情况,使用TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)确定关键基因在泛癌中表达情况.

1.11 生存分析

根据以上结果,使用Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)在线数据库对具有差异表达的基因进行预后评估,绘制了LIHC患者的总生存期(Overall survival,OS)和非进展生存期(PFS,progression-free survival)的生存曲线.OS指从随机化开始至死亡的时间,常常被认为是肿瘤临床实验中最佳的疗效终点.而PFS指从随机化开始到肿瘤发生(任何方面)进展或(因任何原因)死亡的时间,通常也作为晚期肿瘤疗效评价的重要指标[13].

1.12 临床相关性分析

利用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)对关键基因进行临床相关性分析,可以展示不同癌症及其亚型/亚阶段中的基因表达水平[14].本研究主要分析差异基因在患者性别、肿瘤分期和癌症分期这3种临床参数的表达情况.

1.13 免疫组化分析

THPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)是免费提供人类编码蛋白信息的公共数据库,它致力于全部24 000种编码人类蛋白质的基因在44个正常组织、18种肿瘤组织、69个细胞系和18种血液细胞的mRNA和蛋白质表达信息.其结果用高分辨率免疫组化(IHC)染色图显示.

1.14 Western blot实验

将HepG2细胞制成单细胞悬液,计数,接种于10 cm培养皿,待细胞贴壁融合至50%后,加入体积分数10%的M.bealei含药血清,继续培养24 h,弃去培养基,用预冷的PBS洗涤,加入含PMSF的细胞裂解液150 μL反复吹打,于冰上裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min,离心15 min,吸取上清液得到细胞总蛋白,用BCA定量试剂盒定量后进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,一抗孵育(体积比1∶1 000),洗涤膜,二抗孵育(体积比1∶8 000),洗涤膜,最后ECL显影,于化学发光成像分析仪中曝光.

1.15 转录因子预测

ChEA3是一个在线平台,整合了CHIP-seq数据、CNCODE、ReMap、GTEx、TCGA以及ARCHS4的RNA-seq数据内的转录因子共表达数据,可用于分析多个基因共同的转录因子.在ChEA3平台(https://maayanlab.cloud/chea3/)输入关键靶点,以“Mean Rank”值排序,筛选前10个调控关键靶点的转录因子.

1.16 统计学分析

本实验数据采用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析,数据采用独立样本t检验分析,以P<0.05 为检验水准,认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 肝癌差异基因筛选(differentially expressed genes,DEGs)

为了识别与肝癌相关的DEGs,从微阵列数据集GSE45267下载了相关的表达谱,并对芯片数据进行归一化处理,归一化过程可以使不同样本中的总表达量一致,更直观地进行表达量的比较,如图1a所示.从GSE45267数据集中筛选了2 119个DEGs,其中744个基因上调,1 375个基因下调(以P<0.05,|log2FC|>1为条件),如图1b所示.热图常用于展示多个基因的表达量及其分组关系.筛选前50个在癌症相对于正常样本中显著差异表达的基因,并进行热图绘制.如图1c所示.

a.均一化图;b.火山图;c热图图1 GSE45267数据集差异基因表达分析结果Fig.1 Results of differential gene expression analysis in GSE45267 dataset

2.2 M.bealei作用于肝癌铁死亡的靶点筛选以及PPI构建

将药物靶点与GSE45267数据集以及铁死亡数据库所得的基因在Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平台上取交集,结果如图2a所示.将得到的5个交集靶点对应的药物、疾病、成分和靶点一一对应,导入Cytoscape3.9.0软件,构建药物-疾病-成分-靶点网络,结果如图2b所示.其中V形表示药物成分,椭圆形表示交集靶点,菱形表示肝癌,六边形表示铁死亡.

a.交集靶点;b.药物成分-疾病-靶点网络构建图2 M.bealei作用于肝癌铁死亡的靶点筛选Fig.2 Screening of the target of ferroptosis in liver hepatocellular carcinoma by the action of M. bealei

2.3 基因的相关性分析

利用GeneMANIA数据库构建了AR、AURKA、AKR1C1、AKR1C3和PTGS2与邻近基因的基因-基因交互网络.结果如图3所示,20个基因与AKR1C3、AKR1C1、AURKA密切相关,其中,与HPGDS、LRAT、WRN和AKR1C2的相关性最大.

图3 基因-基因交互网络Fig.3 Gene-gene interaction network

2.4 分子对接结果分析

将5个交集基因(AR、AURKA、AKR1C1、AKR1C3、PTGS2)编码的蛋白与M.bealei相对应的活性成分进行分子对接,对接分数越高说明化合物与治疗靶点的亲和力越好.完整的对接结果如表1所示,其中AKR1C3结合棕榈酸酯等,AKR1C1结合β-香豆素棕榈酸酯等,AURKA结合小檗胺,PTGS2结合β-香豆素棕榈酸酯等,AR结合车轴草醇等,其中打分最高的5个关键蛋白与化合物结合细节如图4所示.

表1 分子对接结果

a.AKR1C3结合棕榈酸酯;b.AKR1C1结合β-香豆素棕榈酸酯;c.AURKA结合小檗胺;d.PTGS2结合β-香豆素棕榈酸酯;e.AR结合车轴草醇图4 分子对接结果Fig.4 Molecular docking result

2.5 基因在癌症中的mRNA表达水平

GEPIA数据库分析结果如图5A所示,肝癌组织中AKR1C1、AKR1C3和AURKA的mRNA表达水平均高于正常组织,且均具有统计学意义(P<0.05).TIMER数据库分析结果如图5B所示,AKR1C3、AKR1C1、AURKA在LIHC患者中的表达同样均高于正常组,且均具有统计学意义(P<0.01).

(A)AKR1C1,AKR1C3和AURKA在肝癌中的表达;(B)核心基因在不同类型癌症中的表达情况*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;a.AKR1C3;b.AKR1C1;c.AURKA图5 核心基因在癌症中的表达水平 Fig.5 Expression of core genes in cancer

2.6 生存分析

利用Kaplan Meier-Plotter 在线工具分析了AKR1C3、AKR1C1和AURKA的预后价值.结果如图6所示,HR>1,说明研究对象是一个风险基因,HR<1,说明研究对象是一个保护因素,HR=1,说明研究对象对生存预后没有影响.结果表明:经过log-rank检验后AKR1C3、AKR1C1、AURKA在总生存期(OS)的P<0.05,具有显著的统计学意义.AKR1C1、AURKA在无进展生存期(PFS)中具有显著的统计学意义(P<0.05),而AKR1C3在PFS期P>0.05,不具有统计学意义.

a.AKR1C3的生存曲线;b.AKR1C1的生存曲线;c.AURKA的生存曲线图6 核心基因的生存分析Fig.6 Survival analysis of core genes

2.7 临床相关性分析

利用UALCAN数据库分析AKR1C3、AKR1C1和AURKA与肝癌患者性别、肿瘤分期、淋巴结转移的相关性,其结果如图7所示.性别相关性分析结果如图7a所示,与对照组相比,男性和女性的肝癌样本中的AKR1C3、AKR1C1和AURKA表达都明显上调.肿瘤分期结果如图7b所示,肝癌患者的1、2、3期观察到AKR1C3、AKR1C1和AURKA的表达显著高于对照组.淋巴结转移分类为N0(无区域淋巴结转移)和N1(1～3例腋窝淋巴结转移),淋巴结转移情况结果如图7c所示,与对照组相比,AKR1C3、AKR1C1和AURKA在N0表达较高,具有统计学意义,但是和N1没有较大相关性.

2.8 免疫组化分析

将AURKA、AKR1C1和AKR1C3提交至THPA(human protein atlas)数据库,分别选择正常肝组织以及肝癌组织,得到组织切片,其结果如图8所示,用相同的AURKA抗体(CAB001454)进行免疫组化,右侧注释部分的Staining是代表免疫染色情况,None代表未染色也就是蛋白无表达,Low代表蛋白低表达,High代表蛋白高表达.根据蛋白图谱结果可知,AURKA在正常肝脏的胆管细胞里不表达,在肝细胞里低表达,在肝癌组织里不表达.

a.正常组织;b.肝癌组织图8 AURKA的蛋白图谱Fig.8 Protein expression profile of AURKA

2.9 M.bealei含药血清对HepG2肝癌细胞AURKA蛋白表达的影响

为了验证以上结果,通过Western blot检测M.bealei含药血清对HepG2肝癌细胞AURKA蛋白表达的影响,其结果如图9所示,与对照组HepG2肝癌细胞组相比,M.bealei含药血清组AURKA蛋白表达明显上调.

a.AURKA及β-action在肝癌细胞和含药血清组的蛋白表达;b.肝癌细胞组和含药血清组中AURKA的蛋白表达量比较图9 M.bealei含药血清对HepG2肝癌细胞AURKA表达的影响(n=3)Fig.9 Effects of drug serum of M.bealei on the expression of AURKA in HepG2 liver hepatocellular carcinoma cells (n=3)

2.10 转录因子的分析

将筛选出来的3个核心基因AURKA、AKR1C1、AKR1C3导入ChEA3预测其转录因子,如图10所示.并且由于AURKA基因与蛋白表达结果不一致,考虑到可能是由于AURKA在转录过程中受到某种转录因子调控,进一步列表分析.如表2所示,以Mean Rank值排序,Mean Rank越低表示其预测的转录因子越准确,由此可以看出核心基因AURKA与转录因子CENPA、DNMT1、FOXM1等的相关性较高,受它们所调控.

表2 转录因子的预测

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤,也是死亡率位居前列的肿瘤.目前,中医药及民族医药因毒副作用小、可用性高等优势,在治疗肝癌中呈现出较好作用.M.bealei可用于肝癌的治疗,但其如何通过调控细胞铁死亡而发挥抗癌作用的机制有待阐明.本文运用网络药理学、生物信息学以及实验验证探讨M.bealei通过作用于铁死亡干预肝癌的作用.

本研究通过生物信息学分析方法使用GEO 数据库中的GSE45267芯片来筛选肝癌与正常组织的差异表达基因,共获得2 119个基因,其中744个为上调基因,1 375个为下调基因,并通过分子对接进一步筛选出5个关键基因:AR、AURKA、AKR1C1、AKR1C3、PTGS2.分子对接结果表明,M.bealei的主要活性化合物与关键靶点具有良好的结合活性,并对关键靶点进行了差异表达分析验证,发现AKR1C3、AKR1C1、AURKA这3个核心基因的mRNA水平在肝癌组织中显著表达,进行生存预后分析发现,只有AKR1C1、AURKA在5年内的生存预后有统计学价值(P<0.05).临床相关性分析表明,根据患者性别、癌症分期和癌症的淋巴结转移情况进行评估,疾病组的AKR1C3、AKR1C1和AURKA的表达与正常组相比都明显上调,表示在肝癌中起关键作用.病理学切片研究结果显示3个核心靶点中只有AURKA在肝癌组织中与正常肝组织有明显差异,所以将研究重点聚焦到AURKA.分子对接结果也显示AURKA与小檗胺结合能力较好.M.bealei的主要成分之一是小檗胺,文献[15]研究显示,小檗胺具有抗炎、抗癌活性,小檗胺在体内通过NF-κB、STAT和MAPK通路发挥抗炎作用.炎症介导肝癌进程的机制尚未完全明确,但慢性炎症在推动肝癌发生发展中发挥着重要作用,高水平系统免疫炎症指数是肝癌患者预后的独立危险因素[16].

铁死亡是一种由细胞内铁和脂质活性氧(ROS)积累引起的细胞死亡模式,在肿瘤发生和发展中起到重要作用.近年来,多种基因和其编码蛋白被鉴定出可以调控铁死亡的进程,其中包括文中分析出的3个核心基因.据文献[17]研究表明:AKR1C1与铁死亡相关,并且具有潜在的肿瘤抑制作用.AKR1C3属于醛缩酮还原酶超家族,作为NADP(H)氧化还原酶,被认为是多种恶性肿瘤和内分泌疾病的治疗靶点[18].AURKA全名Aurora kinase A,是一种丝氨酸/苏氨酸细胞周期激酶,调节哺乳动物细胞的有丝分裂过程.多项研究表明[19-21]:AURKA表达上调与肿瘤恶性程度呈正相关.相关研究发现[22]:AURKA信号通路在癌症中过表达,可能是一个潜在的肝癌的治疗靶点,AURKA也被文献[23-24]证实与铁死亡相关.为了进一步确定M.bealei在肝癌中对AURKA蛋白表达的影响,笔者进行了细胞实验.结果发现:与对照组HepG2肝癌细胞组相比,M.bealei含药血清组的肝癌细胞AURKA表达明显上调.

肝癌组织中AURKA的基因表达水平高于正常组织,与病理学切片研究的蛋白表达水平结果相反.而转录因子是一群DNA结合蛋白,它的功能是调节基因转录,在调控基因的表达上起着重要作用,转录因子可对靶基因产生抑制或促进作用.因此,根据转录因子的特性与功能分析上述结果可能与转录因子的调控相关,笔者进行了转录因子的预测.分析结果表明:CENPA、DNMT1、FOXM1等转录因子主要调控基因AURKA的表达,推测可能是由于这些转录因子影响了核心基因AURKA的转录及表达,使AURKA在正常组织和肝癌组织中的基因与蛋白表达水平相反.同时,AURKA在调控铁死亡干预肝癌中起关键作用,将来或许可以通过调控这些转录因子从而干预肝癌的治疗.基于上述分析结果,确定了AURKA是M.bealei通过调控铁死亡而干预肝癌治疗的最佳靶点.

综上所述,本研究采用网络药理学从多成分、多靶点和多途径阐述了M.bealei防治肝癌的物质基础,联合生物信息学的方法对肝癌基因芯片数据进行挖掘,且进一步结合细胞实验以及转录因子预测分析发现M.bealei通过作用于AURKA调控铁死亡而干预肝癌治疗.