9.375 GHz微波长期辐射对秀丽线虫的影响

张文丽,李志慧,董国福,魏丽亚,王长振

(1.河北大学 生命科学学院,河北 保定 071002;2.军事医学研究院 辐射医学研究所,北京 100850)

微波属电磁辐射,广泛应用于国防、通信和医疗科技等领域,给人们带来便利的同时,也使人们暴露于电磁污染中[1].长期处于一定强度的电磁辐射环境下,可能使人产生失眠、抑郁,甚至诱发癌症等[2-4].X波段微波指频率在8～12 GHz的无线电波,在现代雷达、制导武器、通信系统等方面得到了长足的发展[5].X波段电磁辐射对CD1孕鼠子代神经系统功能有明显影响,可导致子代雌鼠和雄鼠的焦虑症状,不导致抑郁症状;可致孕鼠子代雄鼠学习记忆能力下降,但对雌鼠学习记忆能力并无明显影响[6].Yin等[7]研究结果显示: S和X波段微波暴露导致大鼠心脏异常电传导的机制可能与微波暴露后Cx43表达减少和分布紊乱相关.9.375 GHz属于X波段微波,可应用于X 波段雷达频率源的设计[8],该频率源雷达对气象目标探测物有非常灵敏的探测能力[9].

目前有关X波段长期持续低功率微波辐射对生物机体产生影响的报道较少. 秀丽线虫作为生物探测器在电磁环境研究中发挥了重要作用.可用来评价对环境刺激敏感程度的指标有:致死率、寿命、细胞凋亡、生殖、运动行为、学习行为、突变体和基因表达模式等[10].本实验以秀丽线虫寿命为研究终点,秀丽线虫衰老的速度与寿命具有很强的相关性.目前对生物机体衰老相关的自由基衰老假说[11]认为,衰老是由于自由基特别是活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)对细胞、组织等的氧化损伤造成的;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是生物体防御氧化损伤的重要抗氧化酶,其活性反映了机体清除氧自由基的能力,与体内自由基的变化呈负相关[12].本研究以野生型株系(N2)和sod-3基因突变株系(gk235)秀丽线虫为研究对象,观察长期持续低功率9.375 GHz频段微波辐射对其运动能力、产卵率和寿命的影响,为深入研究微波辐射对机体的影响提供参考.

1 材料与方法

1.1 秀丽线虫的培养

本实验使用的野生型株系(N2)和sod-3基因突变株系(gk235)秀丽线虫均由美国线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center,CGC)惠赠.实验时将同步发育至L1期的秀丽线虫转移至含有E.coilOP50的9 cm秀丽线虫生长培养基(nematode growth medium,NGM)中,置20 ℃生化培养箱内常规培养.

1.2 辐射条件

将同步化后发育至L1期的秀丽线虫(每皿(1 000±100)只)接种到NGM培养基中,辐射组置于频率为9.375 GHz,SAR值为4 W/kg的条件下进行长期不间断辐射(24 h/d);对照组置于屏蔽网中进行假辐射,微波辐射装置见图1.辐射开始当天,记为第0天.辐射至第10天时,随机挑出100只秀丽线虫继续辐射,直至秀丽线虫全部死亡为止.

图1 微波辐射装置Fig.1 Diagram of microwave radiation installation

1.3 生殖能力的测定

辐射过程中,当秀丽线虫发育至L4期时,各组随机挑取3只转移到涂有E.coliOP50的3.5 cm NGM培养基中,每天统计产卵量并更换新培养基,直到产卵结束,实验重复3次.

1.4 运动能力的测定

在秀丽线虫连续辐射至第7天和第10天时,每组随机选取10只分别测定其头部摆动、身体弯曲和咽部震动次数,每只观察记录时长均为30 s.

1.4.1 头部摆动次数的测定

将秀丽线虫转入没有食物的NGM培养基上,使其自由活动2 min 以适应环境,于体视显微镜下观察,同时用录像软件记录每只秀丽线虫的运动情况,以秀丽线虫身体弯曲至体长一半计为完成1次头部摆动.

1.4.2 身体弯曲次数的测定

将秀丽线虫转移至不含食物的NGM培养基上,使其自由活动适应2 min,记录身体弯曲次数,以秀丽线虫向前爬行时完成一个S形运动计为1次身体弯曲.

1.4.3 咽部震动次数的测定

将秀丽线虫转移到含有食物的NGM培养基上适应1 h,通过显微镜及录像软件统计30 s内秀丽线虫咽部的震动次数.

1.5 寿命观察

秀丽线虫辐射至第10天时,随机挑出100只移至新的NGM培养基继续24 h/d辐射,每日观察并记录各组秀丽线虫存活数和死亡数,直至全部死亡(铂金丝刺激秀丽线虫无反应者记为死亡).

1.6 统计学方法

本研究数据以均数±标准差表示.秀丽线虫头部摆动、身体弯曲和咽部震动次数数据的比较均采用两因素方差分析;前3天产卵数的比较采用重复测量方差分析,产卵总数的比较采用独立样本t检验.使用Kaplan-Meier法估计生存率,生存率的比较采用Log-rank检验.P<0.05代表差异有统计学意义.采用SPSS 25.0软件和GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析与制图.

2 结果

2.1 长期低功率微波辐射对秀丽线虫头部摆动次数的影响

辐射第7天和第10天时,N2株系秀丽线虫对照组与辐射组头部摆动次数每30 s分别为(4.50±1.20)、(3.80±0.86),(3.05±0.50)、(2.30±0.54)次.与对照组相比,第7天时,辐射组秀丽线虫头部摆动次数呈下降趋势,但无统计学差异;第10天时显著减少(P<0.05).秀丽线虫头部摆动次数随年龄的增长呈下降趋势,结果见图2a.

a.N2株系;b.sod-3基因突变株系图为30 s内秀丽线虫头部摆动次数;与对照组比较,* P<0.05,**P<0.01图2 微波辐射对秀丽线虫头部摆动次数的影响(n=10)Fig.2 Effect of microwave radiation on the number of head swing of Caenorhabditis elegans(n=10)

sod-3基因突变株系秀丽线虫辐射第7天和第10天时,对照组与辐射组头部摆动次数每30 s分别为(6.90 ±1.52)、(3.80±1.03),(4.50±1.18)、(2.30±0.82)次.与对照组相比,第7天和第10天时辐射组秀丽线虫头部摆动次数均显著减少(P<0.01),结果见图2b.

2.2 长期低功率微波辐射对秀丽线虫身体弯曲次数的影响

辐射第7天和第10天时,N2株系秀丽线虫对照组与辐射组身体弯曲次数每30 s分别为(4.00±0.85)、(3.55±0.80),(2.65±0.47)、(2.10± 0.70)次.与对照组相比,辐射组秀丽线虫身体弯曲次数呈下降趋势,但无显著差异.秀丽线虫身体弯曲次数随着年龄的增长呈下降趋势,结果见图3a.

a.N2 株系;b.sod-3基因突变株系图为30 s内秀丽线虫身体弯曲次数;与对照组比较,**P<0.01图3 微波辐射对秀丽线虫身体弯曲次数的影响(n=10)Fig.3 Effect of microwave radiation on the number of body bends of Caenorhabditis elegans(n=10)

sod-3基因突变株系秀丽线虫辐射第7天和第10天时,对照组与辐射组身体弯曲次数每30 s分别为(6.30±1.25)、(3.70± 1.05),(4.20±1.03)、(2.30±0.82)次.与对照组相比,第7天和第10天时辐射组秀丽线虫身体弯曲次数均显著减少(P<0.01),结果见图3b.

2.3 长期低功率微波辐射对秀丽线虫咽部震动次数的影响

辐射第7天和第10天时,N2株系秀丽线虫对照组与辐射组咽部震动次数每30 s分别为(90.20±8.08),(75.90±12.81)、(39.60±17.91)、(30.80±22.24)次.与对照组相比,辐射组秀丽线虫咽部震动次数呈下降趋势,但无显著差异.秀丽线虫咽部震动次数随着年龄的增长呈下降趋势,结果见图4a.

sod-3基因突变株系秀丽线虫辐射第7天和第10天时,对照组与辐射组咽部震动次数每30 s分别为(97.50±7.66)、(89.10±8.95),(66.90±8.94)、(60.30±11.64)次.与对照组相比,第7天和第10天时辐射组秀丽线虫咽部震动次数呈下降趋势,但均无统计学差异,结果见图4b.

2.4 长期低功率微波辐射对秀丽线虫生殖能力的影响

N2株系秀丽线虫产卵量在第2天达到最大值,与对照组相比,辐射组总产卵量略低于对照组,但无统计学差异(P>0.05).sod-3基因突变株系秀丽线虫产卵量与N2株系秀丽线虫相似.辐射对N2和sod-3基因突变株系秀丽线虫的产卵总数均无影响,结果见图5.

a.N2 株系;b.sod-3基因突变株系图5 微波辐射对秀丽线虫产卵量的影响Fig.5 Effect of microwave radiation on the egg production of Caenorhabditis elegans

2.5 长期低功率微波辐射对秀丽线虫寿命的影响

生存曲线结果(图6)显示,N2株系秀丽线虫辐射第11天出现死亡,第18天全部死亡;sod-3基因突变株系秀丽线虫辐射第11天出现死亡,第19天全部死亡.与对照组相比,辐射组N2和sod-3基因突变株系秀丽线虫的存活时间均无显著差异(P>0.05).

a.N2 株系;b.sod-3基因突变株系图6 微波辐射对秀丽线虫寿命的影响(n=100)Fig.6 Effect of microwave radiation on the lifespan of Caenorhabditis elegans(n=100)

3 讨论

已有研究表明:电磁辐射可引起生物体应激、精子异常与代谢紊乱.例如:在频率为10 GHz,功率密度为10 mW/cm2(3 h/d,30 d)的连续波模式暴露下,会导致大鼠皮肤应激反应相关的分子标志物发生显著变化,主要包括ROS、NF-κB、iNOS/NOS2、COX-2、己糖激酶、乳酸脱氢酶和柠檬酸合酶等指标的改变[13].albino大鼠在怀孕期间,全身暴露于频率2.45 GHz,SAR 1.73 W/kg微波(2 h/d)下,可导致雄性子代睾丸结构明显变化,如生精小管形状不规则和睾丸直径显著减小等[14].Bessho等[15]研究显示:间歇性电磁暴露可使秀丽线虫出现运动错乱、发育异常、咽部震动频率下降等改变,但随着暴露时间的延长机体可产生耐受和补偿,从而恢复到正常水平.孙永彦等[16]研究表明:50 Hz极低频电磁波暴露可致线虫能量代谢增强,引起成虫初期的氧化应激反应.Pomerai等[17]研究表明:长期的微波电磁辐射可增强热休克蛋白的表达,导致线虫的热休克效应.综上所述,微波辐射可造成机体不同程度的损伤,但X波段长期持续低功率微波辐射损伤效应的研究较少.秀丽线虫具有繁殖快和寿命短等特点,易实验操作,且其运动能力可直接反映线虫抵御外界压力的能力;咽部震动频率可反映机体代谢和运动能力;产卵率可直接反应机体生殖能力.因此,本文主要利用模式生物秀丽线虫探究X波段长期持续低功率微波辐射是否对机体产生影响.

秀丽线虫已被用作微波诱导应激的生物监测器[18].有研究表明电磁辐射暴露引起机体氧化应激,造成ROS水平升高,过量的ROS攻击细胞中各种生物大分子造成机体生殖系统损伤[19],也有研究报道了由电磁辐射引起的秀丽线虫行为反应和衰老,与氧化应激引起的行为反应和衰老可能都是通过Ins/IGF-1信号通路作用的[20].衰老被高度保守的信号传导通路所调节,调节秀丽线虫寿命和抗逆性的2个主要信号通路是DAF-16/FOXO和SKN-1/NRF-2.ROS水平升高会激活胰岛素样信号通路中心调节因子daf-16下游多个靶基因的表达,包括mtl-1,sod-3,ctl-1,gst-4等多个抗氧化酶基因的上调,来抵御氧化应激[21].sod-3作为胰岛素信号通路下游基因,其表达产物SOD酶可以减轻氧化代谢副产物ROS对细胞的损伤,对寿命延长起重要作用.本研究发现辐射后sod-3基因突变株系秀丽线虫的各项运动指标的下降与N2株系秀丽线虫各指标的趋势一致,但sod-3基因突变株系秀丽线虫头部摆动与身体弯曲次数显著减少,且存在时间和辐射的交互作用,推测微波辐射引起秀丽线虫行为的改变,可能是通过影响sod-3基因表达或产生ROS所致,具体机制有待深入研究.

秀丽线虫的早期产卵率、寿命和运动能力已被证实是辐射影响生理状态的敏感指标[22].Cao等[18]发现在SAR为3 W/kg的1 750 MHz射频场中长期暴露对秀丽线虫发育速度、繁殖和寿命没有显著影响,但促进了秀丽线虫生长速度和生殖发育相关基因的表达,这些差异可能是由射频辐射造成的微弱热效应导致.本实验结果发现,长期(24 h/d,N2株系18 d,sod-3突变株系19 d)辐射后,秀丽线虫产卵量和存活时间与对照组无显著差异.结果表明,持续长期低功率辐射对秀丽线虫的生殖能力和寿命并无影响.

综上所述,长期持续低功率微波辐射可降低秀丽线虫的运动能力,使机体抵御外界损伤能力有所下降.本研究初步探究了低功率微波长期辐射对秀丽线虫的影响,主要为后续深入研究X波段长期持续低功率微波辐射损伤机体的作用机制提供参考.