过表达NtMYB4a基因增强烟草抗旱能力

李红强，罗 倩，杨 帅，谢瑞莹，聂 琼,2*

(1. 贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025)

烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物，烟叶产量和品质直接影响其经济价值。生产中烟草正常生长发育常受到生物或非生物胁迫干扰，从而降低烟叶品质及产量[1]。干旱胁迫是烟草种植中常发生的非生物胁迫之一，会导致烟草生长变得缓慢、光合色素降解、细胞膜受损、活性氧(ROS)量增加以及细胞含水率下降等，抑制烟草的正常生长发育，直接导致烟叶产量和品质下降[2]。

转录因子(Transcription Factor, TF)又称反式因子，是细胞核内一种能与靶基因启动子区特异DNA片段(顺式作用元件)发生特异性相互作用的调节蛋白。在植物生长过程中，转录因子广泛参与生物和非生物胁迫的应答及生长发育调控，在植物信号传导途径中起着至关重要的作用[3]。MYB转录因子是植物体内最大的转录因子家族之一[4]。研究表明，过表达 MYB的转基因作物抗旱性提高，如干旱胁迫下过表达 TaMYBsml-D 拟南芥(Arabidopsis thaliana)转基因后代的脯氨酸含量及发芽率显著高于野生型，叶片失水速率和 MDA含量相对于野生型有显著下降，一些干旱胁迫响应基因(DREB2A、P5CS1、RD29A)的表达上调[5]；超表达OsMYB55的玉米(Zea mays)转基因株系在干旱和高温条件下，其株高、茎粗、生物量及叶绿素含量均较野生型提高[6]；在番茄(Lycopersicon esculentum)中超表达MYB49基因使干旱胁迫下转基因株系 ROS、MDA含量及电解质渗漏率降低，POD和SOD活性、叶绿素和脯氨酸含量、光合速率提高，表明超表达MYB49基因提高了 ROS清除能力，降低细胞膜损伤及细胞死亡，保护叶绿体等，进而提高抗逆性[7]。

本研究以NtMYB4a过表达和CRISPR/Cas9敲除株系及其野生型烟株为材料，分析三个株系在干旱胁迫和复水条件下的光合与生理指标，探讨NtMYB4a应对干旱胁迫的生理功能，为进一步解析NtMYB4a参与抵抗干旱胁迫的调控机理及其在植物抗旱基因工程中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州大学烟草品质重点实验室自育烟草品系GDH88(WT)、NtMYB4a过表达株系(OE)、NtMYB4a敲除编辑株系(KO)。

1.2 方法

1.2.1 干旱处理

采用盆栽实验，待烟苗长至五叶一心后选取大小一致的株系移栽至内径14.8 cm、高13.1 cm盆中，基质土壤为透气性和保水性都较好的风干泥炭土。移栽后15 d进行干旱胁迫处理(8 d不浇水)[8]，在干旱胁迫处理当天(CK)、干旱处理的第2天、第4天、第6天、第8天和复水处理第2天，取各材料从上往下第3、4片叶和根，将叶迅速用液氮处理后放于–80 ℃冰箱保存备用。取样时间为每天早上 9:30，每处理40株，3个重复。

1.2.2 光合作用指标测定

于上午9:00～11:00 (温度24～28 ℃)使用便携式光合作用仪 Li-6400(Li-COR，林肯，NE，美国)测量从上往下第三片叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)，设定 CO2浓度 500 μmol·mol–1，光照强度 1500 μmol·m–2·s–1。每处理测定 3 株取平均值。

1.2.3 生理相关指标测定

叶绿素含量测定用 95%乙醇浸提法[9]。根系活力、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性参照苏州格瑞思生物技术有限公司试剂盒的方法测定。脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量采用张志良等[10]的方法测定。

1.3 数据处理

用 DPS7.05软件采用最小显著差异法(LSD)分析差异显著性，采用Origin2021软件制图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下三个株系的形态变化

干旱胁迫下三个株系的外观形态变化如图 1。胁迫第4天，三个株系的叶片均开始表现出发黄、萎蔫的现象，随着处理时间延长，烟叶萎蔫程度加重。干旱第6 天，KO株系叶片边缘开始枯萎。第8天，OE株系2片叶枯萎，WT株系3片，而KO株系5片叶均枯萎。复水2 d后，OE株系所有叶片均正常展开，WT株系有3片叶恢复正常，但是恢复的叶片发黄，KO株系仅有两片烟叶恢复正常，其余全部枯萎。对比三个株系，其抗旱能力从强到弱依次为OE株系、WT株系、KO株系。

图 1 干旱及复水条件下三个株系的形态变化Fig. 1 Morphological changes of three strains under drought stress and rehydration conditions

2.2 干旱及复水条件下根系活力和叶绿素含量变化

如图 2A所示，各株系根系活力随干旱胁迫时间延长呈先升高后降低的趋势，胁迫第2天三个株系的根系活力都达到峰值后开始下降，复水2 d后，各株系的根系活力又显著提高。在胁迫前后 OE株系的根系活力均显著高于 WT株系。胁迫前期KO株系的根系活力显著高于WT株系，随着胁迫时间的延长，KO株系的根系活力逐渐低于对照。

如图2B所示，随着干旱胁迫时间延长，OE和WT株系的叶绿素含量均呈持续下降趋势，而敲除突变株系则呈现先降低后升高的现象，但KO株系下降幅度均高于OE和WT株系。复水2 d后，各株系叶绿素含量均得到较好的恢复。

2.3 干旱及复水条件下的光合变化

如图3A所示，处理0 d，OE株系的净光合速率(Pn)显著高于KO和WT株系，而KO和WT株系之间无显著性差异。随着干旱时间延长，三个株系的Pn都呈持续下降趋势，且第8 d达最低值。复水后OE株系的Pn恢复至正常水平，而KO和WT株系未完全恢复。

如图3B所示，干旱处理0 d，OE株系蒸腾速率(Tr)和KO株系之间无显著差异，WT株系显著低于突变株系。随着干旱胁迫程度加剧，各株系Tr都呈持续下降趋势。三个株系Tr在第8天达最低值。复水2 d后各株系Tr均恢复到正常水平。

图 2 根系活力和叶绿素含量变化Fig. 2 Changes of root activity and chlorophyll content

如图3C所示，干旱处理0 d，OE株系气孔导度(Gs)显著低于KO和WT株系，KO株系Gs最大。随着干旱胁迫程度加剧，三个株系的Gs变化趋势与Tr和Pn一致，都呈现持续下降趋势，三个株系Gs在第8天达最低值，且在复水2 d后恢复至正常水平。

图 3 干旱及复水条件下的光合特征动态变化Fig. 3 Dynamic changes of photosynthetic characteristics under drought and rehydration conditions

2.4 干旱及复水条件下MDA和Pro含量变化

如图 4A所示，正常生长下，OE、KO和 WT株系的 MDA含量无明显差异，随着干旱胁迫时间延长，三个株系的 MDA含量都呈现先增加后降低的趋势，在干旱处理第6天达到峰值，复水2 d后MDA含量降低。OE株系的MDA含量在胁迫任何时期都显著低于KO株系，表明过表达NtMYB4a可以减少干旱胁迫对细胞膜的损伤。

如图4B所示，随着干旱胁迫时间延长，三个株系的Pro含量均显著增加，且OE株系的Pro含量增加幅度最大，KO株系和WT株系的Pro含量则无明显差异。

2.5 干旱及复水条件下抗氧化酶活性变化

如图5所示，在干旱处理0天时，OE、KO株系的 SOD、POD 活性与WT株系无显著差异，但随着胁迫时间的延长 SOD、POD 活性增加，且增加幅度OE株系＞WT株系＞KO株系；复水2 d后SOD、POD 活性下降。干旱处理0天时，OE株系CAT活性显著高于KO株系，在胁迫第2天三个株系之间 CAT活性无显著差异，随着胁迫时间延长OE株系的 CAT活性增加幅度最大。表明过表达NtMYB4a可以显著增加烟株在干旱胁迫下的抗氧化能力。

图 4 干旱及复水条件下MDA和Pro含量的变化Fig. 4 Changes of MDA and Pro contents under drought and rehydration conditions

图 5 干旱及复水条件下抗氧化酶活性变化Fig. 5 Changes of antioxidant enzyme activities under drought and rehydration conditions

3 讨论与结论

干旱胁迫严重影响烟草的生长发育，表现在形态、光合能力等诸多方面。本研究中，三个烟草株系在自然干旱8 d后，烟叶对干旱胁迫的敏感程度不同，KO株系叶片接近死亡，对干旱胁迫较为敏感，而 OE株系叶片仅呈现发黄萎蔫的状态，对干旱胁迫相对不敏感。

根系活力反映植物吸收土壤中营养物质和水分的能力[11]。本研究发现，在干旱胁迫第2天，3个株系的根系活力均显著提高，这与张杰等[12]研究结果一致，说明适度的干旱胁迫能够刺激根系生长。随着胁迫程度增加，各株系根系活力逐渐降低，且在复水后都得到提高，但各时期 OE株系的根系活力均显著高于WT株系，而KO株系的根系活力低于WT株系。

叶绿素是植物在生长发育过程中形成光合产物必不可少的成分，其含量可以反映叶片生理活性变化[13]。有研究表明，植物叶绿素含量会随着干旱胁迫程度的增加而逐渐下降[14]，本研究中各株系在干旱胁迫后叶绿素含量均呈现下降，但是 OE株系的叶绿素含量在干旱胁迫下相较于其他两种株系均能保持更高的水平。这与霍永锦等[15]的研究结果一致，说明抗旱性强的品种在干旱胁迫条件下能够维持较高的叶绿素含量。

植物的光合生理特征受干旱程度和干旱时间的影响[16]。净光合速率(Pn)是判断植物有机物累积速度快慢的重要指标之一，植物对逆境的耐受能力与净光合速率呈正相关关系。此外，蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)是衡量植物叶片保水能力的主要指标，植物叶片保水能力与蒸腾速率和气孔导度呈负相关关系。研究表明，植物受到干旱胁迫会导致叶片气孔关闭，使胞间CO2浓度升高，进而降低Pn及Tr[17]。本研究发现，随着干旱胁迫时间延长，三个株系的Pn、Gs及Tr显著降低，而OE株系在干旱胁迫处理过程中Pn显著高于WT株系，说明OE株系对干旱的耐受能力更强，能够更好地维持植株生长。同时OE株系的Gs及Tr相对较低，其保水性能可能较好。

干旱胁迫会引起植物体内活性氧(ROS)形成，使膜脂质过氧化，积累丙二醛(MDA)[18]，损伤植物细胞膜。脯氨酸(Pro)作为一种渗透调节物质，对细胞的渗透调节起着关键作用[19]。由于抗氧化胁迫性常被用来判断植物抗旱能力[20]，植物自身可通过产生如SOD、POD和CAT等抗氧化酶来清除活性氧。增强植物的抗氧化防御能力可以提高植物对不同胁迫因子的耐受性[21]。本研究表明，在干旱胁迫条件下，OE株系的MDA含量显著低于WT株系，Pro含量显著高于WT株系，且随着胁迫时间延长，OE株系相较于WT株系始终具有更高的SOD、POD和CAT活性，而KO株系的SOD、POD和CAT活性相较于WT株系更低。这说明OE株系遭受的膜损伤更小，且干旱处理后细胞膜更稳定。

综上所述，NtMYB4a过表达的株系在受到干旱胁迫时，其烟叶枯萎程度低，光合能力和根系活力更强，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性更高，细胞膜损伤也较小，在复水后相关生理指标的恢复程度也更好。表明过表达 NtMYB4a基因可以增强烟草抗旱能力。