转BpTCP7白桦耐盐碱能力分析

张 园，李芳蕊，李 洋，许思佳，安琳君，李慧玉

(东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

我国盐渍化和次生盐渍化土地有4000万hm2以上，占现有耕地的四分之一，而且盐渍化日趋严重，影响到我国农林业的生产。目前，盐碱地综合治理主要依靠生物措施，发掘更多的耐盐植物是当前解决盐渍化的重要手段。植物耐盐机制研究的深入及基因工程育种的发展，为培育耐盐植物特别是林木品种提供了新途径。

TCP是植物特有的一类转录因子。TCP基因家族具60个氨基酸残基组成的碱性区-螺旋-环-螺旋(bHLH)的TCP保守结构域(TCP domain)[1]。根据其TCP结构域不同分为2个亚家族，ClassⅠ(TCP-P)和ClassⅡ(TCP-C)，BpTCP7属于ClassⅡ亚类[2]。研究表明，TCP在植物中参与多种植物激素的应答反应，通过偶联这些激素响应过程来调控植物生长发育过程，如分枝、株高、叶形、花形、种子萌发、维管束生长、配子体发育、光形态建成以及昼夜节律调控。另外，在植物低温、高盐等逆境胁迫应答反应中发挥一定的作用[3-10]。

白桦(Betulaplatyphylla)是我国东北地区蓄积量最大的乡土速生阔叶树种，也是天然次生林更替的先锋树种。前期，通过基因工程育种手段获得了转BpTCP7基因过表达白桦植株，本研究以转TCP7白桦为材料，检测NaHCO3胁迫后的各转基因株系的生长量、保护酶类、渗透调剂物及MDA含量等指标，分析其耐盐碱能力，并筛选抗盐碱优良的株系，为利用植物改良盐碱地提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2年生转BpTCP7基因过表达白桦株系4个(分别为TCP7-1，TCP7-2，TCP7-3，TCP7-4)及非转基因对照株系(WT)。通过组培扩繁，每个株系扩繁50株。选择规格相同的塑料花盆，装入等量培养土，将苗木移入盆中，第2年夏，在植物生长旺盛时，株系内选择生长基本一致的植株用于NaHCO3胁迫处理试验。

1.2 试验方法

1.2.1 处理方法 分别选取每个株系各36株，分成3组，每组各12株，每盆1株，分别向盆内浇入1、2、4 g·L-13种不同质量浓度的NaHCO3溶液，以浇入等量清水为对照。每天浇施500 mL·株-1溶液，处理时间为12 d。分别在处理0、3、6、9、12 d时，取植株第3～5片功能叶，每个株系每个处理各采样20片左右，在液氮条件下充分混合研磨成粉末，进行各指标测定。胁迫处理12 d后，对试验苗木复水。

1.2.2 指标测定 超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用NBT比色法[11]，游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸浸提-酸性茚三酮显色法[12]，丙二醛(MDA)含量采用TBA 比色法[13]。

生长量的测定：盐处理前和复水20 d分别用塔尺测定主干高度，计算高生长量和相对生长量。高生长量= 处理结束后树高-处理前树高；相对生长量=(处理高生长量/对照生长量)×100%。

1.2.3 数据分析与处理 数据统计分析和作图由Excel和SPSS 16.0软件系统完成。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3胁迫对细胞保护酶活性的影响

SOD是氧自由基代谢的关键酶类，可以清除植物体内的自由基，在逆境条件下其活性高低可反映机体的抗逆能力[14]。从图1A可以看出，在0.2%NaHCO3胁迫3 d后，转基因及对照株系的SOD活性变化不明显；6～9 d时，除了TCP7-4外，其他各株系SOD活性逐渐上升；9 d时各株系的SOD活性最高，尤其以TCP7-1最为显著；随着胁迫时间进一步延长，各株系SOD活性下降。总体上看，在整个胁迫过程中，转基因及对照株系的SOD活性差异不显著。在0.4% NaHCO3处理过程中，3 d开始SOD活性提高，但转基因与对照株系差异不显著；6 d时，转基因株系的SOD活性显著高于对照株系；9 d开始，各株系的SOD活性下降，除TCP7-3外，其他各转基因株系的SOD高于对照株系(图1B)。0.8%NaHCO3胁迫过程中，3 d时，各株系的SOD活性达到了顶峰，TCP7-1、TCP7-2的SOD活性显著高于对照株系；随着胁迫时间延长，各株系的SOD活性明显下降，但大部分时间点转基因株系的SOD活性均高于对照株系(图1C)。

图1 NaHCO3胁迫对转基因及对照株系的SOD活性的影响

2.2 NaHCO3胁迫对脂膜的影响

MDA为脂膜过氧化的终端产物，其含量多少可以反映生物膜的危害程度，即MDA的含量越高，生物膜损害越严重[15]。从图2A可以看出，低浓度NaHCO3胁迫6 d前，转基因及对照株系的MDA含量变化均不明显；胁迫9～12 d时，各株系MDA活性表现出上升的趋势；在这2个时间点，各转基因株系的MDA含量均低于对照株系，尤其是TCP7-2株系。在中浓度的NaHCO3处理过程中，6 d时各株系MDA的活性提高，但转基因与对照株系差异不显著；胁迫处理9 d时，大部分转基因株系的MDA活性显著高于对照株系(图2B)。高浓度NaHCO3胁迫过程中，各株系的MDA含量随着胁迫时间的延长逐渐上升，各株系的MDA含量均低于对照株系，尤其是TCP7-4株系(图3C)。

图2 NaHCO3胁迫对转基因及对照株系的MDA含量的影响

2.3 NaHCO3胁迫对渗透调节物质的影响

由图3A可以看出，在0.2%NaHCO3胁迫3 d时，转基因及对照株系的脯氨酸含量提高，但各株系间差异不显著；胁迫6 d时，转基因株系TCP7-3、TCP7-4显著高于对照株系；胁迫9 d时，2个转基因株系的脯氨酸含量下降，与其他各株系间无显著差异。在0.4%NaHCO3胁迫3 d时，各株系的脯氨酸含量急剧上升，转基因株系的含量高于对照株系；6 d时，除TCP7-3外，其他各转基因株系的脯氨酸含量均高于对照株系，并达到最高峰；随着胁迫时间的继续延长，脯氨酸含量降低。0.8%NaHCO3胁迫后，3 d及6 d时各株系的脯氨酸含量均上升，除TCP7-1外，其他转基因株系的上升幅度明显高于对照株系。

图3 NaHCO3胁迫对转基因及对照株系的脯氨酸含量的影响

株系高生长/cm0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3相对生长量/%0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3WT13.25±1.25b20.00±1.89b10.80±0.92b---TCP7-18.58±1.33a13.25±1.32a12.67±1.28b6566117TCP7-29.42±1.83a18.17±2.03b18.00±1.24c7191167TCP7-37.58±0.95a17.00±1.75b8.00±0.86a578574TCP7-412.58±1.56b25.50±1.59c26.33±1.98d95128244

2.4 NaHCO3胁迫对植株高生长的影响

从表1可以看出，0.2%、0.4%的NaHCO3处理后，只有TCP7-4株系的高生长高于对照株系，其他3个转基因株系均低于对照株系；但0.8%的NaHCO3处理后，除TCP7-3株系外，其他各株系的树高生长量均高于对照株系，最高的是TCP7-4，相对生长量达到244%，TCP7-2次之，相对生长量是167%。

3 结论与讨论

目前针对TCP的研究集中于发育调控，在抗逆方面的研究鲜见报道。OsTCP19在调节非生物胁迫中发挥了重要的作用，盐和干旱条件下水稻中OsTCP19基因的表达量上调了5～6倍，并且在拟南芥中过量表达的OsTCP19引起ABI3、ABI4、IAA3的上调表达和LOX2下调表达，导致植株的发育异常[16]。在水曲柳中，研究FmTCP4对冷、盐及旱的响应发现，FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫，并且其响应模式并不相同。NaCl处理后，FmTCP4基因的表达呈现先上调后下调的趋势，在6 h出现显著上调，达到峰值，为对照的70.69倍[17]。在水稻中证明了过量表达或抑制OsTCP14(PCF6)和OsTCP21显著降低或增加植物的冷脆弱性，且OsTCP14(PCF6)和OsTCP21在冷胁迫下负调控ROS介导的逆境胁迫反应[18]。在前期研究中发现，白桦TCP7启动子中含有盐、旱及ABA响应元件，通过NaCl及PEG处理后TCP7启动子表现出一定的响应。本研究对转TCP7白桦进行不同浓度的NaHCO3胁迫处理，发现低浓度的NaHCO3处理后转基因及对照株系差别不明显，但中、高浓度的NaHCO3处理后，对照株系的细胞膜损伤程度明显高于转基因株系，而渗透调节物及活性氧清除酶类的积累明显低于转基因株系，说明BpTCP7基因提高了白桦的抗盐碱能力。

综上所述，转TCP7白桦株系在NaHCO3胁迫下，能有效诱导体内的保护酶系统，清除体内的活性氧，降低膜脂氧化损伤，一定程度上维持了植物正常的生理代谢活动。同时，通过体内渗透调节物质的积累，起到了渗透调节的作用，使得转TCP7白桦对NaHCO3等逆境适应性增强。