通过式固相萃取柱/超高效液相色谱-串联质谱法快速检测饲料中8 种糖皮质激素

赵天珍，宋长江，何国成，丘金珠，梁 莹，宋海霞

（ 中山市农产品质量安全检验所，广东 中山 528400 ）

糖皮质激素可分为内源性及人工合成的糖皮质激素。由于具有解热、抗炎和抗过敏的作用，合成类糖皮质激素被添加在动物饲料中[1-2]。动物生长过程中过量使用这些激素会导致其在动物源性食品中残留，进而影响人类健康[3]，故已被各国禁止在饲料中添加。糖皮质激素药物的残留检测方法有免疫分析法[4]、毛细管电泳法[5]、液相色谱法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]、液相色谱-飞行时间质谱法[8]等。其中，液相色谱法等常用于快速筛查，无法准确定性；液相色谱-飞行时间质谱法设备昂贵，使用成本高；液相色谱-串联质谱法具有选择性好灵敏度高等优点，应用广泛。通过式固相萃取小柱（PRiME HLB）是近年来通过式固相萃取柱[9-10]建立的样品前处理新技术，具有操作简单、无活化和平衡、净化效率高等优点，广泛应用于兽药残留检测。高洁等[9]建立了PRiME HLB 同时检测猪肉中52种同化激素。检测饲料中糖皮质激素[11]的报道并不多见，应用PRiME HLB检测饲料中糖皮质激素未见报道。

本研究以配合、浓缩和添加剂预混合饲料为目标，选择动物源性食品中有检测要求的8种糖皮质激素（泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氢可的松）为研究对象，利用PRiME HLB净化、UPLC-MS/MS测定，基质工作曲线和同位素内标法定量，为饲料中糖皮质激素类药物的风险筛查和监测工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

标准品：泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氢可的松、氟氢可的松-D5、泼尼松-D4、氢化可的松-D3纯度均大于98.5%，购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈均为色谱纯，购自默克公司；甲酸，色谱纯购自CNW 公司；Oasis PRiME HLB（3 mL/60 mg）、Oasis PRiME HLB（6 mL/200 mg）购自Waters 公司；氯化钠购自广州化学试剂公司；0.22 μm有机滤膜购自津腾公司；陶瓷均质子购自Agilent公司；配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料来自中山市农检所样品室。

1.1.2 主要仪器设备

1290+6495A 液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源，安捷伦公司）；MSA125P-CE 十万分之一天平、Quintix1102-1CN 百分之一电子天平（赛多利斯公司）；3-30ks高速离心机（SIGMA公司）；FV64氮吹仪（德泰公司）；KQ-500TDE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Vortex2 振荡器（IKA 公司）；200 μL、1 000 μL、10 mL移液器（eppendorf公司）。

1.2 标准溶液和内标配制

1.2.1 8种糖皮质激素混合标准使用溶液

取泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松、倍他米松、倍氯米松、地塞米松、醋酸氟氢可的松标准物质，用十万分之一天平准确称量，纯度换算后用乙腈溶解配制成1 000 mg/L标准溶液，-18 ℃冰箱保存。

使用时用乙腈液逐级稀释用乙腈配制成100 μg/L 混合标准使用液，现配现用。

1.2.2 同位素内标使用液配制

取氟氢可的松-D5、泼尼松-D4、氢化可的松-D3标准物质，用十万分之一天平准确称量，纯度换算后用乙腈溶解配制成1 000 mg/L 标准溶液，-18 ℃冰箱保存。使用时用乙腈逐级稀释配制成1.00 mg/L 同位素内标混合使用液，现配现用。

1.3 分离条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）。流动相：A 相为0.005 %甲酸水溶液，B 相为乙腈，流速0.4 mL/min，柱温45 ℃，进样量为5 μL，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.2 质谱条件

检测方式为多反应监测MRM；电离方式为电喷雾离子源负模式；干燥气温度：200 ℃，干燥气流量：14 L/min，干燥气压力：35 psi，鞘气温度：350 ℃，鞘气流量：11 L/min，电压：380 ℃。8 种糖皮质激素和3 种同位素内标的质谱条件见表2。

表2 8种糖皮质激素药物和3种同位素内标的质谱参数Tab.2 Mass spectrometric parameters of eight glucocorticoids and three isotope internal standards

1.4 基质匹配工作曲线

准确称取样品1.00 g（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，取100 μg/L的8种糖皮质激素混合标准使用液（1.2.1）加标，分别加入20、50、100、200、400、500、600、1 000 μL，分别得到浓度2、5、10、20、40、50、60、100 μg/L工作曲线，再加入1.00 mg/L 同位素内标使用液（1.2.2）50 μL，其余前处理按照1.5中步骤进行。

以糖皮质激素浓度和同位素内标浓度比值为横坐标（X），以各特征离子色谱峰峰面积与内标的峰面积比为纵坐标（Y），绘制基质工作曲线。

1.5 样品处理

准确称取样品1.00 g（精确至0.01 g），加入1.00 mg/L内标（1.2.2）50 μL，加入8 mL 0.5%甲酸-60%乙腈水溶液，1 个陶瓷均质子，加入4 gNaCl，涡旋2 min，超声提取20 min，10 000 r/min冷冻离心5 min，吸取上层全部有机相过3 mL/60 mg 的Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，流速1 滴/s，挤干，氮气吹至近干，40%甲醇水溶液复溶液定容1.00 mL，过0.22 μm微孔滤膜过滤后分析测定。

1.6 回收率

在配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中分别添加5、10、50 μg/kg的8种糖皮激素类药物进行准确度试验，每个浓度做6个平行样，计算平均回收率。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 提取溶剂的选择

本试验以罗非鱼配合饲料、浓缩饲料和添加剂（微量元素）预混合饲料为基质，糖皮质激素常用的提取剂有乙腈[12]、甲醇[13]、乙酸乙酯[7]。祝曙华[14]检测了饲料中5 种糖皮质激素，发现使用甲醇提取时，大量杂质溶出，而乙腈提取杂质很少。并且考虑到后续操作需加入盐分层操作的简便性，因此不能选择甲醇溶剂。

本试验考察了乙酸乙酯、乙腈、60%乙腈溶液、80%乙腈溶液、含0.5%甲酸-60%乙腈水溶液和含1.5%甲酸-60%乙腈水溶液这6种溶剂对试样加标的平均回收率影响，结果见图1。结果表明，0.5%甲酸-60%乙腈水溶液回收率较好。

图1 提取溶剂对8种糖皮质激素平均回收率的影响Fig.1 Effect of different extraction reagents on recovery rate of eight glucocorticoids

2.1.2 提取体积的选择

本试验选择了0.5%甲酸-60%乙腈水溶液作为提取溶剂，并对溶剂体积作了探讨。选取4、8、12 mL 对8 种糖皮质激素提取回收率的影响，结果见图2。

图2 提取体积对8种糖皮质激素平均回收率的影响Fig.2 Effect of different extraction volumes on recovery rate of eight glucocorticoids

由图2可知，使用8 mL提取溶剂的回收率高于4 mL，而8 mL 和12 mL 回收率差异不明显，考虑到环境友好原则，选择8 mL作为提取体积。

2.1.3 液相条件的优化

本试验考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），由于地塞米松和倍他米松是同分异构体，用Agilent Poroshell 120 EC-C18分离效果更佳，故本试验选择Agilent Poroshell 120 EC-C18。

进一步优化流动相种类、梯度洗脱程序、流速、柱温和进样体积，8种糖皮质激素峰形均对称尖锐，详细液相和质谱条件见1.3.1 和1.3.2，饲料中添加8 种糖皮质激素的MRM总离子色谱图见图3。

图3 空白饲料中添加8种糖皮质激素的MRM色谱Fig.3 MRM chromatograms of a blank feed spiked with eight glucocorticoids

2.2 方法的线性关系、相关系数、检出限和定量限

按照1.5 前处理条件及1.3.1、1.3.2 色谱分离条件进行测定，以糖皮质激素浓度和同位素内标质量浓度比值为横坐标（X），以各特征离子色谱峰峰面积与内标的峰面积比为纵坐标（Y），绘制工作曲线，并计算获得待测物质的线性回归方程及相关系数，并以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限和定量限，结果见表3～表5。

表3 8种糖皮激素类药物在配合饲料的线性方程、检出限和定量限Tab.3 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in compound feed

表4 8种糖皮激素类药物在浓缩饲料的线性方程、检出限和定量限Tab.4 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in formula feed

表5 8种糖皮激素类药物在添加剂预混合饲料的线性方程、检出限和定量限Tab.5 Linear equation, detection limit and quantification limit of eight glucocorticoids in additive premix feed

由表3～表5可知，在浓度为2～100 μg/L范围内，8种糖皮质激素呈良好的线性关系，相关系数均大于0.998，饲料的检出限为0.2～1.6 μg/kg，定量限为0.6～4.8 μg/kg，略高于农业部1063 号公告—5—2008[15]标准中检出限2 μg/kg 和定量限5 μg/kg，远优于农业部1068号公告—2—2008[16]标准中检出限0.5、1.0 mg/kg，故满足饲料中糖皮质激素风险筛查的技术要求。

2.3 回收率检测结果

向配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中分别添加8 种糖皮质激素的混合标准溶液，添加浓度分别为5、10、50 μg/kg，按照1.5方法进行处理，3个添加水平下重复测定6次，平均回收率结果见表6。由表6可知，8种糖皮质激素的回收率为80.6%～96.2%。根据GB/T 27404—2008标准要求，当添加量＜0.1 mg/kg，标准规定回收率为60%～120%，本方法测定回收率远远优于规定要求，表明本研究建立的方法准确度满足检测工作需求。

表6 配合、浓缩、添加剂预混合饲料中8种糖皮质激素类药物加标回收率结果（n=6）Tab.6 Spiked recovery of eight glucocorticoids informula feed, concentrated feed and additive premix feed（ n=6）

2.4 实际样品检测

为验证本方法可靠性，应用本研究建立的方法对10种配合饲料、5 种浓缩饲料和2 种添加剂预混合饲料进行检测，同时作质控样品。样品经前处理和上机测试后，对其中8种糖皮质激素进行定性筛查，可疑样品结合特征离子比，样品均未检出糖皮质激素。加入的质控样品加标回收率达到定量分析要求，表明方法和结果可信。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

本试验考察了乙酸乙酯、乙腈、60%乙腈溶液、80%乙腈溶液、含0.5% 甲酸-60% 乙腈水溶液和含1.5% 甲酸-60%乙腈水溶液这6种溶剂对试样加标的平均回收率影响。结果表明，乙酸乙酯和乙腈为提取溶剂，3种饲料的加标回收率较低，可能乙酸乙酯共提物较多，对目标提取物干扰严重；乙腈沉淀蛋白易结块，导致提取目标物不充分；乙腈水溶液提取效率高于乙酸乙酯、乙腈，其中体积分数为60%乙腈溶液提取效率高于体积分数80%乙腈溶液，可能是水有助于提取水溶性物质；体积分数60%乙腈溶液中加入0.5%甲酸提取效率高于1.5%甲酸，可能是酸度过高影响了离子化效率，流动相中加入0.5%甲酸利于目标化合物的离子化，响应有所提高，重复性好，故选择0.5%甲酸-60%乙腈水溶液，这与郭添荣[17]报道结论基本一致。

3.2 不同固相萃取柱对回收率的影响

饲料样品蛋白脂肪含量较高，使用乙腈溶液提取后会含有脂溶性物质，因而为减少对仪器污染，选择净化效果较好的固相萃取柱。有文献采用固相萃取柱[11]、分散固相萃取[18]、整体在线净化[19]等方法，操作较烦琐，耗时长，有机溶剂用量较大。有文献采用通过PRiME HLB 净化鱼肉[20]、育发液[21]、化妆品[22]中糖皮质激素，但未见PRiME HLB 应用于饲料中糖皮质激素检测前处理的报道。本研究采用PRiME HLB通过式固相萃取柱，无须活化和平衡，能够有效吸附脂溶性杂质，净化效率高，操作简单，前处理时间短，重现性好。本试验选取两种型号的PRiME HLB（3 mL/60 mg和6 mL/200 mg），对回收率进行比较；结果显示，3 mL/60 mg 平均提取回收率更好，故选择3 mL/60 mg PRiME HLB固相萃取柱。

3.3 基质匹配工作曲线和同位素内标法同时定量

同位素内标法优点较多，如定量时可以有效避免样品前处理提取过程对目标组分丢失造成定量不准确的影响，但无法避免基质效应的影响。基质效应是指在样品检测过程中，除目标组分以外的物质对目标组分的影响，有基质增强或减弱效应。王博等[23]研究测定了配合饲料中11种蛋白同化激素含量，发现基质对部分目标物具有抑制作用。消除基质效应常见方法有基质匹配工作曲线、内标法、改进净化方法等。由于饲料基质复杂，饲料种类繁多，不同饲料基质差别较大，通过选择基质工作曲线和同位素内标法同时定量，既可以消除或减弱基质效应的影响，还能够避免样品前处理中目标物的损失。因此，优化后的方法回收率可达80%以上，准确度高。

3.4 不足之处

饲料种类繁多，除了几种常见饲料外，还有一些特殊类型的饲料，如宠物饲料、饲料添加剂和混合型饲料添加剂、植物源性和微生物发酵类等研究对象，本研究未涉及，未来需要进一步探究。此外，本研究只使用了3种同位素内标，部分化合物回收率略低，不到90%，原因可能为使用3 种内标结构与结构存在差异，未来研究中将寻找合适的同位素内标进行试验。

4 结论

本试验以配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料作为研究对象，建立了8种糖皮质激素快速筛查糖皮质激素的分析方法，样品经0.5%甲酸-60%乙腈水溶液提取后离心，上清液经Oasis PRiME HLB 固相萃取柱净化后使用氮吹仪吹干，用40%甲醇溶液溶解上液相色谱串联质谱仪测定，基质工作曲线和同位素内标法同时定量。8 种糖皮质激素添加回收率为80.6%～96.2%，检出限为0.2～1.6 μg/kg，定量限为0.6～4.8 μg/kg。结果表明，该方法前处理操作简单、快速，净化效果好，基质效应不明显，灵敏度高，准确性好，建立的分析方法适用于饲料中多种糖皮质激素检测，可为风险监测和监督抽查提供技术支持。