中草药微生态复方制剂对南美白对虾的安全性评价

张铭林，欧梦馨，谢映红，肖 琦，周琳玉，谢小东，胡庭俊

（ 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 53005 ）

南美白对虾是世界上体型最大、产量最高的对虾之一，具有肉质鲜美、生长迅速、营养丰富等特点，其产量占全球对虾产量的80%以上[1]。近年来，南美白对虾的养殖规模和密度不断增大，养殖池中大量的饲料、对虾排泄物、残留饲料等可导致养殖水体恶化，威胁对虾健康[2]。采用传统的抗生素防治疾病，使病原菌对抗生素产生抗药性[3]。因此，人们更加关注替代抗生素的疾病防治方法。其中草药微生态制剂结合了中草药和益生菌的双重优势，不仅具备提高动物生长性能、免疫功能、抗氧化和抗炎能力[4]，还能够通过抑制病原菌、增强免疫反应提高机体的抗病力[5]，因而受到广泛关注。本实验室通过将山药、马齿苋等中草药和枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等益生菌配制而成一剂中草药微生态复方制剂，并在前期研究中发现该制剂能够有效增强南美白对虾的生长性能和免疫功能水平[6]。为进一步探究中草药微生态复方制剂作用于南美白对虾的安全剂量范围，证明中草药微生态复方制剂对于南美白对虾的安全性，本试验通过观察对虾在超过推荐剂量下的生长性能、临床表现、血液生化指标和病理组织学分析，对该制剂的安全性进行评价，为后续的临床应用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药物

中草药微生态复方制剂含有山药、马齿苋、黄精等中药和枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等益生菌菌粉，由广西大学动物科学技术学院药理实验室配制。

1.1.2 试验动物

试验用南美白对虾750 尾，体重（2.0±0.3） g，体长（5.0±1.0） cm，来自广西东兴南美白对虾养殖基地。对虾临床表现健康，采食正常，虾线正常。

1.1.3 试剂与仪器

总蛋白定量（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；饲料专用黏合剂购自北京鑫洋水产高新技术有限公司；柠檬酸三钠（分析纯）购自北京索莱宝科技有限公司；Bouin's固定液购自北京索莱宝科技有限公司。

UV-1750 型紫外可见光分光光度计（岛津公司）、Multimode Plate Reader 酶标仪（PerkinElmer）、Direct-Q 5UV 纯水系统（Merck Millipore）、AB104-L 电子分析天平（梅特勒-托利多）、3K-15 台式高速冷冻离心机（Sigma）、HH-S2 数显恒温水浴锅（金坛市医疗器械厂）、ZT-12M2自动生物组织病理脱水机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）、YB-6LF 生物组织包埋机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）、LEICA RM2245半自动轮转式切片机（徕卡公司）、YT 型生物组织摊烤片机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）、YR-21 生物组织切片染色机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）、光学显微镜（Nikon eclipse 80i）。

1.2 试验饲料制备

根据实验室前期研究，中草药微生态复方制剂的临床推荐剂量为每1 kg 饲料中添加10 g。饲料制备时按照比例准确称取中草药微生态复方制剂和南美白对虾商品料后，再按照饲料专用黏合剂说明书用量称取适量黏合剂加入复方制剂中，随后添加适量纯水迅速搅拌均匀呈稀糊状，最后混合入称取的南美白对虾商品料中，充分翻拌混匀，使复方制剂包裹在虾饲料上，在通风处晾干。

1.3 试验设计与饲养管理

750 尾南美白对虾随机分为5 组，每组3 个重复，每个重复150尾虾。设置1个空白对照组和4个试验剂量组，各试验组添加中草药微生态复方制剂剂量分别为推荐剂量的1、3、5、10倍剂量。试验分组及处理见表1。

表1 试验分组及处理Tab.1 Grouping and treatment of experimental animals

养殖试验在广西东兴市鸿生实业有限公司的室内专业养殖车间进行，试验虾养殖于2 m×2 m专业养殖池内，水深0.8 m左右。将750尾试验虾随机分到15个小养殖池内，每个小养殖池50尾，试验开始前正常养殖7 d以适应环境。养殖用水为过滤海水，水温（28±2） ℃，pH值8.0～8.4，24 h充氧，盐度为23.0‰，每天清污一次，每两天换水一次，每次换水量1/4。各组投喂相应的试验饲料，每天投喂4次（时间分别为8:00、12:00、17:00、22:00），每天投喂量为虾体重的1%～3%，投喂1 h后清除剩余饲料。试验期30 d。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 临床体征观察

从给药开始连续观察30 d，每日观察受试虾的临床表现、采食与排便的情况并记录。

1.4.2 体重与体长

用药后第15 和第30 d 时，每组随机捞取30 尾受试虾测定体重和体长，并计算30 d 的平均增重率和平均增长率。同时完整剖取出受试虾的肝胰腺，称量后用Bouin's固定液固定，计算肝胰腺的脏器指数。

1.4.3 血液生化指标

用药后第15和第30 d时，每组随机捞取30尾虾抽血。用75%酒精将南美白对虾的腹血窦部位消毒，先抽取适量预冷的抗凝剂（5%柠檬酸三钠），在与虾体成45°左右的方向进针抽取受试虾血液，将血液转移至1.5 mL 灭菌EP 管中混匀，抗凝剂补足体积至与血液体积比为1∶1，-40 ℃保存。测定TP、ALB、CREA、ALT、AST 和TG 等指标，测定方法严格按照试剂盒说明书操作，注意先进行预试验确认测试浓度，若需要稀释可用生理盐水。

1.4.4 组织病理学检查

取固定好的肝胰腺，通过酒精逐级脱水、石蜡切片、苏木素伊红（HE）染色、脱水封片等步骤进行病理组织切片制作，观察肝胰腺组织形态是否发生变化,并采集图像。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著 。

2 结果与分析

2.1 中草药微生态复方制剂对南美白对虾临床表现的影响

试验期内，各池中南美白对虾摄食情况良好，运动活跃，虾线呈正常的棕黑色，流畅无断节，粪便粗细均匀，颜色正常，长度1～2 cm，无异常气味，未出现中毒表现。

2.2 中草药微生态复方制剂对南美白对虾体指数的影响（见表2、表3）

表2 中草药微生态复方制剂对南美白对虾体重及肝胰腺指数的影响Tab.2 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on body weight and hepatopancreas index of Penaeus vannamei

表3 中草药微生态复方制剂对南美白对虾体长的影响Tab.3 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on body length of Penaeus vannamei

由表2可知，用药后第15 d时，Ⅱ组、Ⅲ组对虾的体重显著高于Ⅰ组（P＜0.05），Ⅳ组对虾的体重极显著高于Ⅰ组（P＜0.01）；用药后第30 d时，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组的体重极显著大于Ⅰ组（P＜0.01）。用药后第30 d时，Ⅱ组平均增重率最大（199.06%），Ⅰ组最小，仅有115.09%。

由表3可知，用药后第15 d时，Ⅱ组、Ⅲ组对虾的体长显著高于Ⅰ组（P＜0.05），Ⅳ组的体长极显著高于Ⅰ组（P＜0.01）；用药后第30 d时，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组的体长极显著高于Ⅰ组（P＜0.01）。用药后第30 d，Ⅲ组的平均增长率最大，为49.61%；Ⅰ组的平均增长率最小，为37.07%。

2.3 中草药微生态复方制剂对南美白对虾血液生化指标的影响（见表4～表6）

表4 中草药微生态复方制剂对南美白对虾血液TP和ALB含量的影响Tab.4 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on blood TP and ALB content of Penaeus vannamei

由表4 可知，用药后第15 d 时，Ⅴ组对虾血液TP 和ALB 含量均显著低于Ⅰ组（P＜0.05）。用药后第30 d 时，Ⅳ组和Ⅴ组对虾血液TP含量极显著性高于Ⅰ组（P＜0.01），Ⅳ组的ALB 含量极显著高于Ⅰ组（P＜0.01），Ⅴ组的ALB含量显著高于Ⅰ组（P＜0.05）。

由表5可知，用药后第15 d，Ⅱ组对虾血液ALT活性、Ⅳ组对虾血液AST 活性极显著低于Ⅰ组（P＜0.01），Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组对虾血液ALT 活性及Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅴ组对虾AST活性均显著低于Ⅰ组（P＜0.05）。

表5 中草药微生态复方制剂对南美白对虾血液ALT和AST活性的影响Tab.5 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on the activity of ALT and AST in blood of Penaeus vannamei

由表6 可知，用药第15 d，与Ⅰ组相比，Ⅲ组和Ⅴ组对虾血液CREA 含量显著降低（P＜0.05）；Ⅱ组TG 含量显著降低（P＜0.05），Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组极显著降低（P＜0.01）。

表6 中草药微生态复方制剂对南美白对虾血液CREA和TG含量的影响Tab.6 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on blood CREA and TG content of Penaeus vannamei

2.4 组织病理学检查（见图1、图2）

图1 给药15 d后南美白对虾肝胰腺组织切片（HE 400×）Fig.1 Hepatopancreas tissue section of Penaeus vannamei 15 d after administration（ HE 400×）

解剖可见各组对虾肝胰腺均未见明显病变，外层白色薄膜包裹内层组织，外观正常。

由图1、图2可知，各剂量组与空白对照组对虾肝胰腺细胞核、质清晰，组织饱满，管腔呈星形，小叶腔空隙正常，空泡数量无异常增多，肝胰腺小管未出现萎缩，未见异常病理变化。

3 讨论

本研究采用中草药微生态复方制剂对南美白对虾连续拌料饲喂30 d，评估其在临床应用中的安全性。结果表明，试验期内，受试虾的摄食行为、运动行为正常，粪便的颜色、质地、气味也无异常，无中毒和死亡现象，表明中草药微生态复方制剂对南美白对虾的临床体征无不良影响。试验期间，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组对虾体重和体长与Ⅰ组相比明显增加，说明以1、3 和5 倍剂量的中草药微生态复方制剂拌料饲喂南美白对虾能够提高其生长性能，这与中草药微生态复方制剂中含有丰富的氨基酸、维生素与微量元素等有关。同时益生菌能够调节肠道微生态平衡，促进消化与吸收，使机体生长性能得到有效提升[7]，这种提升效果在仔猪[8]、产蛋鸡[9]、鲤鱼[10]等动物中均有报道。

试验期间，Ⅴ组对虾血液TP 和ALB 含量呈先下降后升高的趋势，而Ⅳ组对虾血液TP 和ALB 含量在用药30 d时显著高于Ⅰ组。由于血液TP由肝脏合成，且TP中包含ALB，因此TP 和ALB 的检测结果能够反映肝脏合成功能[11]。齐飞等[12]在饲料中添加1%复合芽孢杆菌制剂饲喂凡纳滨对虾，发现血液TP 和ALB 含量显著上升。陈家祥等[13]研究发现，饲料中添加地衣芽孢杆菌会提高肉鸡血清ALB含量。上述研究结果均表明，中草药微生态复方制剂拌料饲喂对南美白对虾血液TP和ALB含量无负面影响。

在甲壳动物中，机体肝脏组织受损时会影响肝脏内氨基酸的代谢水平，同时大量的ALT 和AST 被释放到血淋巴中[14]，导致血液AST 和ALT 活性显著升高。本研究中，各剂量组对虾血液AST 和ALT 活性均未明显升高，肝胰腺指数也无明显变化，肝胰腺组织显微结构与正常肝胰腺组织结构相似，这些结果均证明中草药微生态复方制剂不会对南美白对虾的肝胰腺组织造成损害。TG是南美白对虾血脂的主要成分之一，主要由肝脏合成代谢，其数值变化能够反映对虾体内脂代谢水平[15]。试验期间，各剂量组对虾血液TG 含量呈先下降后上升的趋势，推测是由于中药中的植物蛋白源导致机体TG含量短时间内出现小范围下降所致[16]。血液CREA 含量上升常提示机体存在潜在的肾功能代谢障碍[17]，而下降一般认为无实际临床意义。本研究中，各剂量组对虾血液CREA 含量均低于Ⅰ组，与谢小东等[18]结果一致，说明中草药微生态复方制剂对南美白对虾肝脏脂质合成与代谢功能无明显破坏作用。

4 结论

本研究结果表明，饲料中添加1倍、3倍、5倍和10倍推荐剂量的中草药微生态复方制剂饲喂南美白对虾30 d，不会对南美白对虾的血液生化指标造成不良影响，不会损害肝胰腺功能与组织结构，且对南美白对虾无毒副作用，使用安全，且对南美白对虾的生长性能具有促进作用。