胆绿素还原酶A rs699512和肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1 rs4149015位点基因多态性与新生儿不明原因高胆红素血症易感性相关性研究

杜 晨,徐 征,高 宇,夏兰兰,李 烨,李 宁

(1.首都医科大学附属北京儿童医院保定医院检验科,河北 保定 071000;2.陆军第八十二集团军医院检验科,河北 保定 071000;3.首都医科大学附属北京儿童医院保定医院新生儿科,河北 保定 071000)

高胆红素血症(Hyperbilirubinemia,HB)是新生儿较为常见的一种疾病,据统计其发病率超过55%,其中20%～30%是不明原因HB[1]。由于病因无法明确,增加了临床诊断与治疗难度,若患儿未得到及时有效治疗,极易发生胆红素脑病,甚至引发不可逆神经系统损害,因此明确易感基因对形成系统防治体系至关重要[2-3]。胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)可通过还原胆绿素生成非结合型胆红素,参与HB发生过程[4]。肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1(Solute carrier organic anion transporter family member 1B1,SLCO1B1)是有机阴离子转运因子1B1(Organic anion transportingpolypeptide 1B1,OATP1B1)的编码基因,具有较高的遗传变异性,在肝脏转载胆红素过程中发挥重要作用[5]。但目前关于BLVRA和SLCO1B1基因位点在不明原因HB中的研究较少。基于此,本研究探讨BLVRA rs699512与SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性在新生儿不明原因HB中的作用及意义,为临床制定针对性防治方案提供借鉴。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2022年1月至2023年1月于本院分娩和治疗的新生儿不明原因HB患儿90例为HB组,另选取同期健康新生儿90例作为对照组。纳入标准:新生儿不明原因HB符合《诸福棠实用儿科学》[6]中相关诊断标准;健康新生儿检查各项指标正常;出生日龄<28 d;两组监护人均对本研究知情,自愿签订知情同意书。排除标准:参与本研究前应用磺胺类、水杨酸类等影响胆红素代谢的药物者;伴有染色体异常、遗传性代谢性疾病者;存在先天性心脏病、先天畸形、先天性胆管闭锁、红细胞增多症、血管外溶血者;合并甲状腺功能异常者;合并感染性疾病者;母婴血型不合者。本研究经本院医学伦理委员会审核并批准(伦理批号:TJIRB20201002)。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集:收集所有研究对象的一般资料,包括性别、胎龄、出生体重、开奶时间、红细胞压积、总胆红素和结合胆红素等数据。

1.2.2 基因多态性检测:采集清晨空腹静脉血2 ml,利用TIANGEN试剂盒提取DNA,紫外分光光度计测量样品DNA纯度与浓度,确认合格后保存于4 ℃冰箱内。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测BLVRA rs699512和SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性。PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司设计,PCR反应体系体积25 μl,反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性20 s,57 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循环37次;72 ℃延伸10 min。取5 μl DNA扩增片段行限制性内切酶消化反应与琼脂糖电泳,在紫外灯光透视下分析BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性检测结果。委托华大基因科技股份有限公司进行DNA测序,采用Mutation Surveyor 4.0软件进行基因序列比对分析。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 见表1。HB组患儿总胆红素和结合胆红素水平明显高于对照组(均P<0.05)。两组其他资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 两组临床资料比较

2.2 两组BLVRA rs699512位点基因型分布和等位基因比较 见表2。两组BLVRA rs699512位点基因型分布比较差异有统计学意义(χ2=9.202,P=0.010)。HB组GG基因型分布高于对照组,AA基因型分布低于对照组(均P<0.05)。HB组G等位基因频率高于对照组(P<0.05)。

表2 两组BLVRA rs699512基因型分布和等位基因比较[例(%)]

2.3 两组SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布和等位基因频率比较 见表3。两组SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布比较差异有统计学意义(χ2=8.751,P=0.013)。HB组AA基因型分布高于对照组,GG基因型分布低于对照组(均P<0.05)。HB组A等位基因频率高于对照组(P<0.05)。

表3 两组SLCO1B1 rs4149015基因型分布和等位基因比较[例(%)]

2.4 不同BLVRA rs699512基因型患儿血清胆红素水平比较 见表4。不同BLVRA rs699512基因型患儿总胆红素和结合胆红素水平比较差异有统计学意义(均P<0.05)。BLVRA rs699512中GG基因型总胆红素和结合胆红素水平高于AA基因型(均P<0.05)。

表4 不同BLVRA rs699512基因型患儿血清胆红素水平比较(μmol/L)

2.5 不同SLCO1B1 rs4149015基因型患儿血清胆红素水平比较 见表5。不同SLCO1B1 rs4149015基因型患儿总胆红素和结合胆红素水平比较差异有统计学意义(均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015中AA基因型总胆红素和结合胆红素水平高于GG基因型(均P<0.05)。

表5 不同SLCO1B1 rs4149015基因型患儿血清胆红素水平比较(μmol/L)

2.6 BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性与HB易感性的关系 BLVRA rs699512位点GG基因型与HB发生呈正相关,AA基因型与HB发生呈负相关(r=0.671、-0.608,均P<0.001)。SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型与HB发生呈正相关,GG基因型与HB发生呈负相关(r=0.695、-0.633,均P<0.001)。

3 讨 论

新生儿不明原因HB在临床较为常见,且近年来发病率逐年升高,成为全球儿科医师面临的重要难题[7-8]。HB发生的主要原因包括遗传和围生期因素,虽然大多患儿经光疗治疗后均可痊愈,但仍有部分患儿可能会发展成胆红素脑病,影响患儿的神经系统,留下后遗症,甚至对其生命带来威胁[9-10]。胆红素在机体内主要由血红素降解,但80%以上降解由网状内皮系统中红细胞血红蛋白完成,剩余降解由骨髓中低效的红细胞生成和其他血红素蛋白完成[11-12]。在血红素加氧酶催化分解下,血红素可被分解为等分子量胆绿素、一氧化碳和铁,其中BLVRA可将胆绿素降解,使其转变为胆红素,当其进入血液后可参与机体血液循环,同时与血清白蛋白结合,经转运后特异性分布于肝脏并在肝细胞基底膜上的有机阴离子转运摄取,最终进入肝细胞[13]。胆红素进入细胞后可与受体蛋白相结合并降解于光面内质网,在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶催化后可进一步生产结合胆红素,其可在水中相融并随之排出体外[14]。

BLVRA是一种胆绿素还原酶,在机体内具体机制为:体内BLVRA蛋白可结合血红蛋白加氧酶-1(HO-1)蛋白,导致其发生催化作用同时对兔血红素氧合酶1(HMOX1)行应激诱导,增加其表达[15]。因此,理论而言HMOX1多态性可对胆红素水平产生影响,两者间应存在密切联系。本研究发现,BLVRA rs699512位点GG基因型与HB发生呈正相关,AA基因型与HB发生呈负相关。在单核苷酸多态性数据库中,有研究发现对于BLVRA基因中rs699512位点突变存在异议,其等位基因频率明显不同,其中白种人、中国人和日本人分别为0.23、0.27和0.40[16],但Chau等[17]研究指出,BLVRA rs699512位点基因与成人血清胆红素无显著关系,本研究与其存在差异,本研究发现HB组患儿BLVRA rs699512位点基因G等位基因频率明显高于对照组,GG基因型分布明显高于对照组,AA基因型分布明显低于对照组,GG基因型总胆红素水平和结合胆红素明显高于AA基因型,提示BLVRA抑制剂可能对不明HB的发生具有明显改善作用。分析原因,主要是由于rs699512位点A>G碱基置换可进一步加快氨基酸-苏氨酸的转变,而蛋白酶的活性与苏氨酸之间存在密切关系,从而改变BLVRA蛋白酶活性[18];此外,由于BLVRA是一类HO-1转录因子,在机体内细胞信号传导中参与并发挥作用,可抑制其合成并降低胆红素的生成[19]。因此,推测BLVRA rs699512位点基因对BLVRA生成产生影响,进而降低胆红素的合成,但具体机制需进一步研究。

SLCO1B1基因位于染色体12p12,在浆膜中的变异表达减少会在一定程度上降低有机阴离子转运多肽2转运活性,未结合胆红素无法完成转运,导致其在体内聚集,引起新生儿不明HB的发生[20]。本研究发现,HB组患儿SLCO1B1 rs4149015位点基因A等位基因频率明显高于对照组,AA基因型分布明显高于对照组,GG基因型分布明显低于对照组,且AA基因型总胆红素水平和结合胆红素明显高于GG基因型。与以往研究不同,Amandito等[21]研究发现SLCO1B1基因位点与新生儿不明原因HB无关。分析原因,可能是由于不同地区人群可能存在遗传有差异[22]。总之,目前在新生儿不明原因高胆红素血症中关于SLCO1B1 rs4149015位点基因的研究较少,且结果争议较大,今后尚待进一步扩大样本研究。

综上所述,新生儿不明原因HB患儿BLVRA rs699512位点GG基因型与SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型会显著增加易感性,临床可建立早期防治体系以改善患儿预后。