应用Cephodex微载体培养DF-1细胞增殖水貂源犬瘟热病毒的技术研究

梅建国，庄金秋*，任强，莫玲，王艳，李峰，郭时金，付石军，赵蕾，王建军

(1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东 滨州 256600；3. 滨州医学院附属医院，山东 滨州 256600)

犬瘟热(canine distemper)是犬科动物的一种急性高致死性传染病，每年给全球毛皮经济动物养殖造成不小的损失[1]。目前该病尚无特效治疗药物，免疫接种仍是行之有效的防控手段[2]，因此，高质量的疫苗产品显得尤为重要。通常犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)在体外细胞上的增殖水平不高，从而影响抗原的免疫原性，使临床免疫失败时有发生[3]。近年来，人们采用了如细胞株筛选、细胞微载体培养技术、培养技术工艺优化等众多技术方法，以提高CDV增殖效率和病毒滴度，也取得了一定的效果[4]。本研究着重分析了在微载体悬浮培养条件下，收毒时间等对CDV增殖滴度的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系与病毒株

鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞、水貂源犬瘟热弱毒CDV3株由山东省滨州畜牧兽医研究院保存。

1.2 试剂与仪器

胎牛血清(FBS)为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；DMEM干粉为无锡市美迪生物制品公司生产；细胞培养级葡萄糖为Sigma公司产品；Cephodex型细胞培养微载体为滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司产品；SBA-40E生物传感分析仪购自山东省科学院生物研究所；Minitron 细胞培养摇床购自瑞士伊孚森生物公司。

细胞生长液：DMEM培养液中加入6%(体积比)的FBS；细胞维持液：DMEM培养液中加入2%(体积比)的FBS。

1.3 DF-1细胞复苏传代、微载体准备与悬浮培养

取DF-1种子细胞1支于37 ℃水浴解冻，常温下1 000 r/min离心5 min后弃上清液。用生长液重悬细胞后无菌转入T75方瓶中，加入适量生长液置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养至72 h。胰酶消化分散后，以1∶3的比率传代扩增。

称取4份0.1 g微载体Cephodex，分别加入4只50 mL三角摇瓶中，并将每瓶加入PBS 10 mL，用玻璃棒搅拌混悬微载体。将4只摇瓶121 ℃灭菌30 min，灭菌后待温度降至80 ℃左右混悬微载体，以防载体结团。更换摇瓶中无菌PBS，每瓶加入1～2 mL细胞生长液，37 ℃孵育24 h～72 h做无菌检验。

无菌检验合格后，弃上清液，保留微载体，备用。用胰酶-EDTA消化液作用T75瓶中DF-1细胞，吹打分散后无菌收集，并用台盼蓝活细胞计数法测定细胞浓度[5]。按每瓶3×106个的细胞量接种，用细胞生长液定容至10 mL，将细胞与微载体混匀后放入Minitron培养摇床中培养。细胞接种后0～6 h为间歇振荡[6]，间歇时间为30～60 min，振荡时间为1～2 min。之后，进入连续振荡阶段，DF-1细胞进行微载体悬浮培养。摇床参数如表1所示。

表1 不同培养阶段摇床控制参数

1.4 CDV3接种与毒价测定

悬浮培养至72 h，DF-1长成细胞单层，取样观察细胞-微载体复合物状态，将接毒组其中1瓶细胞培养液更换成细胞维持液，并按感染复数(MOI)为2.06×10-3接种CDV3[7]，另3瓶做计数的细胞取其中1瓶作健康细胞对照。将接毒细胞和对照细胞置于35 ℃环境中连续振荡培养，其他参数不变，这些培养条件均是建立在前期研究成果基础之上的[8]，具体参数如表2所示。病毒接种后24 h开始取样，采用Reed-Meunch法[9]测半数细胞感染量(TCID50)，每隔24 h测定1次。

表2 CDV3增殖阶段摇床控制参数

1.5 细胞计数与日糖耗量测定

细胞在悬浮培养阶段，取其中3瓶摇瓶细胞每24 h做细胞计数，并用生物传感分析仪测培养液中葡萄糖含量。另外1瓶细胞只测糖含量，不做细胞计数，作为CDV3接种用。4只摇瓶培养液中葡萄糖的起始浓度为4.0 g/L，当培养液中葡萄糖含量低于2.0 g/L时，及时向培养液中流加200 g/L的葡萄糖溶液100 μL，以满足细胞高密度生长的营养需求。

根据培养液中葡萄糖初始浓度、向培养液中流加的葡萄糖量、以及每24 h所测得培养液中的葡萄糖含量，计算细胞日糖耗量，观察细胞在染毒前以及染毒后的日糖耗量变化[10]。

统计分析：试验数据用“平均值±标准差”表示，方差分析进行统计。

2 结果

2.1 DF-1细胞的微载体培养

2.1.1 细胞在Cephodex上的生长状态

经胰蛋白酶消化分散制备的DF-1细胞悬液与Cephodex微载体混合均匀，经过6 h间歇振荡培养，细胞能很好地粘附于载体表面。此时，载体表面的细胞还未铺展，多数为圆形，少数铺展的细胞呈梭形，如图1A所示。图1B可以看出，培养至24 h，细胞已在载体表面铺展生长，并与载体紧密贴附，且每个微球表面基本都有细胞生长，几乎没有空球现象。图1C表明，至48 h，载体微球表面80%以上区域都形成了细胞单层。在37 ℃条件下，由于DF-1细胞生长迅速，至72 h，微载体表面形成完整的细胞单层。一些载体微球表面，细胞进一步生长成致密的复层或多层结构，进而形成明显的突起形状，如图1D所示。

A. 6 h；B. 24 h；C. 48 h；D. 72 h。

在间歇振荡阶段，DF-1细胞在Cephodex微载体上黏附快、上球率高、形态良好。在连续振荡阶段，细胞在微载体表面活力高、生长旺盛，形成致密的细胞单层和多层结构。结果表明，Cephodex微载体与DF-1细胞的相容性好，非常适合该细胞的悬浮培养。

2.1.2 细胞生长曲线与糖耗水平

取其中3只摇瓶微载体培养的DF-1细胞，37 ℃培养72 h。从细胞接种开始，每24 h取样做细胞计数，测定细胞密度，结果如图2所示。同时，所有4只摇瓶细胞每24 h取样测培养液中葡萄糖含量，计算细胞日糖耗量，结果如图3所示。

图2 3只摇瓶生长培养阶段的DF-1细胞生长曲线

图3 4只摇瓶生长培养阶段的DF-1细胞的糖耗曲线

从图2、图3可以看出，37 ℃条件下，测细胞密度的3只摇瓶细胞生长迅速，细胞密度上升快，培养48 h细胞数达2.0×106个/mL以上，且这一时间里的细胞糖耗量也呈快速上升趋势。48 h后，细胞密度仍有增加，但增速明显放缓。至72 h，细胞密度达峰值，约3.0×106个/mL以上，此时进行病毒接种。细胞生长阶段的生长曲线和糖耗曲线表明，细胞计数的3只摇瓶细胞生长曲线差异小，且糖耗曲线也相近。因此，细胞糖耗与细胞密度之间存在高度的正相关性。为了减少对后续病毒增殖试验的影响，另外1瓶细胞未取样做细胞计数。从图3的4瓶细胞日糖耗量曲线来看，未计数摇瓶的细胞密度与计数的3瓶十分相近。

2.2 CDV3的感染增殖

2.2.1 CDV3感染DF-1产生的CPE

CDV3感染后不同增殖时间Cephodex表面的DF-1病变见图4。在接毒组细胞培养至24 h，未接毒的健康细胞仍保持良好的生长状态，如图4A。健康组细胞培养至48 h，尽管在微载体上的密度不断增大，形成致密的多层结构，但很少从载体上脱落，如图4B。健康细胞在培养至72 h后，细胞已明显衰退，培养液中已开始出现游离凋亡的DF-1细胞，如图4C。继续培养至96 h，载体上的细胞进一步脱落，一些载体表面开始出现空球现象，如图4D。

健康细胞：A. 24 h；B. 48 h；C. 72 h；D. 96 h；染毒细胞：E. 24 h；F. 48 h；G. 72 h；H. 96 h。

由图4E可见，在CDV3接种后24 h，接毒组的DF-1细胞尽管有部分细胞从载体上脱落，但细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)并不明显。图4F表明，至48 h已有明显的CPE现象，细胞开始圆缩，并从微载体表面脱落。但细胞脱落相对较少。72 h病变已相当严重，细胞大量脱落，如图4G所示。至96 h几乎所有细胞均完全病变，载体上基本没有正常的DF-1细胞附着，见图4H。

2.2.2 不同培养时间的病毒滴度、日糖耗量之间的差异

细胞接种病毒后，每24 h取样测病毒滴度，同时测定同一培养时间的健康组与染毒组细胞培养基葡萄糖含量，计算细胞日糖耗量。病毒滴度测度结果如表3。

表3 接毒后不同培养时间的CDV3滴度

不同培养时间样品的TCID50测定结果，经IBM SPSS软件分析发现，摇瓶中Cephodex微载体培养的DF-1细胞接种CDV3后，培养0和24 h的病毒滴度与培养48、72、96 h的病毒滴度差异显著(P<0.05)，培养48 h与培养72 h和96 h、培养72 h与培养96 h的病毒滴度差异显著(P<0.05)。细胞接毒72 h内培养物中病毒滴度呈上升趋势，表明这段时间内病毒增殖水平较高。而培养72 h后病毒滴度开始下降，至96 h下降达100.6TCID50/0.1 mL。这一结果按活病毒浓度计，则降至72 h的75%。结合图4可以看出，72 h后大量细胞病变，并从载体表面脱落，至96 h载体上已基本没有完整的细胞附着，表明病毒在这段时间已逐渐失去维持其增殖的活细胞基础。因此，病毒滴度降低是必然的，而病毒接种后72 h则成为病毒收获的最佳时间节点。

日糖耗量曲线见图5。在病毒增殖阶段，细胞糖耗水平也呈现一定规律性变化。病毒接种后48 h内，健康组细胞保持着较为稳定的糖耗水平，而接毒组细胞糖耗则快速增加，这可能与病毒的大量增殖有关。至48 h，病毒接种组细胞日耗糖量达最高水平。48 h后，随着病毒增殖和细胞病变的增加，载体表面的活细胞数量进一步减少，接毒组细胞日糖耗量显著下降。此时健康组细胞日糖耗量也开始有所降低，这可能与细胞活力降低有关，但其下降幅度明显小于病毒接种组。至72 h，接毒组与健康组细胞的日糖耗量十分相近，表明两组细胞在活力上基本处于同一代谢水平。此时，接毒组细胞的日糖耗量几乎降至其峰值水平的一半，而健康细胞的日糖耗量下降则非常小，仅降低10%左右。至接毒后96 h，接毒组细胞的日糖耗量已不足峰值水平的30%，而此时健康细胞的日糖耗量仍能维持在其峰值水平的70%以上。由此可见，能引起CPE的病毒，在病毒增殖初期可使细胞日糖耗量快速增加；而在病毒增殖的中后期，由于细胞的大量病变死亡，从而使得细胞日糖耗量呈急剧下降趋势。

图5 细胞感染CDV3后与健康细胞的糖耗量变化曲线

3 讨论

细胞状态的优劣、细胞数量的高低对病毒滴度的水平和病毒抗原稳定性有着直接影响。为了让DF-1细胞能在短时间内快速稳定生长，在细胞生长阶段，培养温度为37 ℃，考察了其中3瓶细胞的细胞糖耗与细胞密度、细胞状态的关系[11]。前者与后两者呈明显的正相关性，并在显微镜下细胞状态和细胞计数结果中得到了验证。由于细胞培养48 h后，细胞密度和细胞日糖耗量均开始下降，表明细胞生长速度开始放缓。至72 h，细胞密度达到峰值，而日糖耗量基本不增，此时进行病毒接种最为理想。当然，若要确定更准确的接毒时间，可对培养时间做进一步的细分研究。由于多次取样细胞计数会导致细胞数量减少，也必然影响后续的病毒增殖结果。而对上清液取样测葡萄糖含量，一般不会导致细胞损失，对病毒增殖的影响也就不大。因此，取其中的3瓶细胞进行计数和测糖耗量，研究二者的数量关系十分必要。并且取其中1瓶作为健康细胞对照，另1瓶接毒用细胞则仅测糖耗量，不做细胞计数。这样，根据所有4瓶细胞日糖耗量和已测定的3瓶细胞密度，可以预测用于接毒的这瓶细胞与3瓶对照组细胞具有相近的细胞密度，因而增加了试验结果的准确性与可靠性。当然，仅凭细胞糖耗来推算细胞密度，可能不够准确，但相比取样带来的细胞损失对病毒增殖的影响，前者的试验误差会小得多。

细胞接种病毒后，48 h内的病毒滴度上升较快，细胞日糖耗量也保持较快增长。而48 h后，细胞开始产生CPE，细胞糖耗呈明显下降趋势，病毒滴度则快速增长。当细胞接毒培养至72 h，大量CPE产生，病毒滴度达到峰值，而糖耗则大幅下降近一半。至96 h，病毒滴度下降达100.6TCID50/0.1 mL，即活病毒浓度下降至72 h的75%，而此时的细胞糖耗不足峰值水平的30%。通过与不接毒的健康细胞进行对比分析可知，病毒增殖72 h可达到滴度高峰，在实际生产中可作为病毒收获的最佳时间。另外，在病毒增殖阶段，随着病毒的增殖和细胞的病变，细胞日糖耗水平呈现一定的规律性变化。TCID50的测定一般需要7 d以上，时间周期长，存在严重的滞后性，这对疫苗等的大规模生产来说，培养物病毒滴度难以实现实时监测，从而影响生产过程控制和生产效率提升。根据病毒增殖阶段病毒滴度与细胞日糖耗量的相互关系，如果后者能代替TCID50测定作为指示病毒滴度的重要指标，那么大规模生产中病毒培养物滴度的实时监测难题便可迎刃而解。从本研究的数据来看，病毒增殖72 h滴度可达到高峰，而此时细胞日糖耗量下降为糖耗峰值的一半。那么接毒后细胞日糖耗量下降至糖耗峰值一半左右时，是否确实为整个病毒增殖阶段的TCID50达峰时间，且是否可作为最佳收毒时间，这需要进一步做大量的研究工作，需要更详实可靠的数据支撑。

综上，本研究应用新型Cephodex微载体悬浮培养技术，高密度培养DF-1细胞增殖CDV3，重点对培养过程的接毒时间、收毒时间、葡萄糖消耗测定等技术环节进行探讨分析，取得了一定的成果。由于仅对CDV3微载体培养工艺中的几项关键技术进行了研究，在工业化疫苗生产中，仍有更多的技术条件有待进一步优化和完善。