4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价

辛凌翔，王豪杰，刘燕，姚文生，胡云皓，张一帜，赵浩然，鑫婷，朱良全*

(1. 中国兽医药品监察所，北京 100081；2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100081)

结核病主要是由分枝杆菌感染引起的一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的人兽共患传染病之一。分枝杆菌种类繁多，现已超过190种[1]，包括结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌等)[2]、麻风分枝杆菌及其他非结核分枝杆菌(NTM)[3]。结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是主要的人兽共患病病原菌[4]，二者基因组同源性达到99.95%，而禽分枝杆菌虽对牛无显著致病性，但牛感染禽分枝杆菌后可干扰牛结核病的检疫[5]。

目前，世界动物卫生组织(WOAH)推荐结核菌素(PPD)皮内变态反应试验检测牛结核病，但该方法检验时间长，主观判断性强，环境分枝杆菌以及副结核分枝杆菌的感染易造成非特异性反应，干扰检测结果[6-7]。病料、奶样和鼻分泌物可以用PCR方法进行疫病诊断并可对感染菌株进行分群鉴定。目前多种基因可作为病原学的检测靶标，其中Mpb64基因为结核分枝杆菌复合菌群的特有基因[8-9]；IS6110属于插入序列 IS3 家族的一个成员，只存在于结核分枝杆菌复合群中[9]，可作为结核分枝杆菌复合群的分子检测靶标[10]；IS1081是结核分枝杆菌复合群共有的插入序列，为功能性转座子，结核分枝杆菌有10～20个拷贝数[11-12]，牛分枝杆菌仅有1～6个拷贝数，该基因可用于鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。此外，16S rRNA也常作为分枝杆菌属的鉴定基因，因其在细菌基因组中的丰度较高且序列较为保守，是进行细菌系统进化和分类的经典方法之一。因此，可以通过检测IS6110[9，13]、IS1081[11，14]、Mpb64[8，15]，快速区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群，将16S rRNA作为分枝杆菌群的鉴定基因。然而，针对不同靶基因所建立的PCR检测方法，其敏感性与特异性存在差异，检测效果存在差异。因此，本研究对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因设计检测体系，采用PCR论证了体系的特异性和敏感性，并利用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测样品的可适性，研究数据对于开展牧场结核病的检测和净化具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 参考菌株及试剂

牛分枝杆菌C68001、牛分枝杆菌AN5、禽分枝杆菌C68202、胞内分枝杆菌C68226、副结核分枝杆菌 C68681、牛种布鲁菌2308株、羊种布鲁菌Rev.1株由中国兽医药品监察所供应；2×TaqPCR Master Mix、细菌基因组核酸提取试剂盒购自TaKaRa公司；7H10固体培养基、7H9液体培养基、OADC增菌液购自BD公司；分枝杆菌阴性的健康牛组织样本由本实验采集并保存；全脂牛奶(蒙牛)，购自超市。

A. 1号引物；B. 2号引物；C. 3号引物；D. 4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；N. 阴性对照；1～11. 退火温度依次为53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63 ℃。

A. 1号引物；B. 2号引物；C. 3号引物；D. 4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；1. 牛种布鲁菌2308；2. 羊种布鲁菌Rev.1；3. 牛分枝杆菌C68001；4. 牛分枝杆菌AN5；5. 禽分枝杆菌C68202；6. 副结核分枝杆菌C68681；7. 胞内分枝杆菌C68226；8. 阴性对照。

A. 1号引物；B. 2号引物；C. 3号引物；D.4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. DNA浓度依次为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 ng/μL。

1.2 引物合成

所有引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。

1.3 测定最适宜退火温度(Tm)

采用生物信息学软件Primer 5评价4对引物的Tm，确定其退火温度范围。PCR反应体系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL；模板、上游引物、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，退火温度为53～63 ℃ (退火温度按照1 ℃梯度递增)，30 s，72 ℃，1 min，循环30 次；最后，72 ℃，延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 敏感性试验

1.4.1 菌液培养及核酸提取

将牛分枝杆菌AN5株冻干菌株用0.2 mL 7H9液体培养基溶解(含10% OADC)，划线接种2支7H10固体培养基斜面，37 ℃静置培养21～30 d，挑取单个干燥颗粒状菌落接种于10 mL 7H9液体培养基，于37 ℃静置培养14 d。菌液转移至15 mL离心管，6 000 r/min离心10 min，弃去上清液；沉淀再用1 mL无菌PBS重悬，转入1.5 mL无菌EP管，于80 ℃水浴灭活2 h，6 000 r/min离心10 min，弃去上清液；按照细菌基因组提取试剂盒革兰阳性菌基因组提取步骤，提取沉淀物的细菌核酸，并用NanoDrop测定其浓度。

1.4.2 最低检测限确定

用TE溶液将核酸浓度10倍倍比稀释(10-3～10-10ng/μL)，并设置阴性对照，然后运用已优化的PCR方法确定不同引物对分枝杆菌复合群基因组的最低检测限。

1.5 特异性试验

1.5.1 菌液培养及核酸提取

将牛分支杆菌C68001株、牛分支杆菌AN5株、禽分枝杆菌C68202株、胞内分枝杆菌C68226株和副结核分枝杆菌C68681株按1.4.1方法培养并提取细菌基因组。牛种布鲁菌2308株、羊种布鲁菌Rev.1株分别接种大豆酪蛋白琼脂平板(TSA)，37 ℃培养3 d后，用5 mL生理盐水洗下，80 ℃水浴灭活2 h，用细菌基因组提取试剂盒提取核酸，并用NanoDrop检测细菌基因组浓度。

1.5.2 PCR特异性检测

使用已优化的PCR反应条件和程序分别对上述菌株核酸进行检测，并设置阴性对照，以检测各个引物的特异性。

1.6 对人工模拟临床样品检测限的测定

1.6.1 人工模拟感染组织样本(肺脏/淋巴结)检测

将牛分枝杆菌AN5单菌落接种至10 mL 7H9液体培养基(含10% OADC)，置37 ℃静置培养14 d，6 000 r/min离心10 min，弃去上清液，无菌PBS溶液重悬菌体，测定OD600值，并用无菌PBS溶液将OD600值调至1.0(约1×108CFU/mL)。用PBS溶液进行10倍倍比稀释，80 ℃灭活2 h，分别加入到肺脏和淋巴结组织匀浆液(100 μL)中，每份匀浆加入10 μL稀释菌液混匀。用组织核酸提取试剂盒，提取基因组作为模板，然后运用已优化的PCR方法进行检测，确定不同引物对组织中核酸的最低检测限。

1.6.2 人工模拟感染牛奶样本检测

将1.6.1步中稀释的各浓度菌液，分别加入到1 mL全脂牛奶中，每份加入10 μL稀释菌液，80 ℃灭活2 h，12 000 r/min离心10 min，弃掉上层乳脂层，用组织核酸提取试剂盒提取基因组后作为模板，运用已优化的PCR方法，确定不同引物对牛奶中核酸的最低检测限。

2 结果

2.1 最佳退火温度(Tm)的确定

经Primer 5软件分析显示，设计的4对引物Tm范围在53～63 ℃之间。以牛分枝杆菌C68001基因组为模板进行PCR扩增。结果显示，4对引物在退火温度53～63 ℃范围内均能扩出目的条带(图1)。综合考虑，选择温度适中的60 ℃作为最佳退火温度，PCR反应程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。

2.2 特异性试验

将提取的牛分枝杆菌C68001、牛分枝杆菌AN5、牛种布鲁菌2308株、羊种布鲁菌Rev.1株、禽分枝杆菌C68202、副结核分枝杆菌C68681和胞内分枝杆菌C68226的核酸作为模板，并设置阴性对照，进行PCR检测。结果显示：1号引物均能够检测牛分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌；2号、3号和4号引物虽然亦均可检测牛分枝杆菌，但禽分枝杆菌检测条带显示均较弱。鉴于牛结核病主要由牛分枝杆菌引起，而禽分枝杆菌可感染牛但不致病，因此2号、3号和4号引物可以用于牛结核病的检测(图2)。由于3号引物在PCR检测分枝杆菌反应中杂带较多，易产生非特异性，因此不适用于临床样品的检测。

2.3 敏感性试验

提取牛分枝杆菌AN5基因组，经NanoDrop检测其浓度为21 ng/μL，用TE将核酸稀释至10-3ng/μL，依次进行10倍倍比稀释(10-3～10-10ng/μL)，运用已优化的PCR反应条件进行检测。结果如图3所示，2号和3号引物对牛分枝杆菌AN5的基因组检测灵敏度最高，均可达10-10ng/μL，而1号引物和4号引物对基因组的检测限分别为10-4ng/μL和10-3ng/μL。

2.4 在模拟临床样本中的应用

2.4.1 人工模拟感染牛组织样本(肺脏/淋巴结)的检测

将10 μL稀释后的牛分枝杆菌的菌液(1×108CFU/mL)分别加入到健康牛肺脏和淋巴结组织匀浆(100 μL)中，用细菌DNA提取试剂盒提取基因组后进行PCR检测。结果显示：1号引物对牛淋巴结和肺组织匀浆中牛分枝杆菌的检测灵敏度最高，可达1 CFU/mL；2号、3号和4号引物对淋巴结和肺组织匀浆的牛分枝杆菌检测灵敏度为105～106CFU/mL (图4、图5)。

A.1号引物；B.2号引物；C.3号引物；D.4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. 牛分枝杆菌AN5的菌液浓度依次是107、106、105、104、103、102、10、1 CFU/mL。

A.1号引物；B.2号引物；C.3号引物；D. 4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. 牛分枝杆菌AN5的菌液浓度分别是107、106、105、104、103、102、10、1 CFU/mL。

2.4.2 人工模拟感染牛奶样品的检测

将10 μL稀释后的菌液分别加入到1 mL全脂牛奶中(1×106CFU/mL)，用组织核酸提取试剂盒提取基因组后进行PCR检测，结果如图6所示。1号和3号引物对人工模拟奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度都可以达到10 CFU/mL，4号引物检测奶样的灵敏度为102CFU/mL，2号引物仅能检出106CFU/mL。

A.1号引物；B.2号引物；C.3号引物；D.4号引物；M. DNA Marker(DL2000)；P. 阳性对照(牛分枝杆菌AN5的DNA)；N.阴性对照；1～6.牛分枝杆菌AN5的菌液浓度分别是106、105、104、103、102、10 CFU/mL。

3 讨论

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患传染病[1]，我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染动物机体后分布于各个器官病灶内，以组织器官结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为典型特征，可随病畜的粪便、乳汁、尿液及呼吸道分泌物等排出。肺脏和淋巴结作为牛分枝杆菌感染的主要靶器官，病原检出率最高，而牛乳是牛结核病风险评估中最易采集、最容易监测的样本[11-12]。虽然目前有针对不同牛分枝杆菌靶基因所建立的PCR检测方法，但不同PCR检测方法对不同组织的检测效果存在差异性。因此，本研究以不同PCR检测方法的特异性、敏感性以及样品可适性为研究指标，以期筛选出针对不同组织样品和牛奶样品的最适牛分枝杆菌特异性基因PCR检测体系。

本研究针对牛分枝杆菌相对保守的4个基因片段(16S rRNA、IS6110、 IS1081、Mpb64)分别设计引物，建立PCR检测方法，并系统评价不同引物对牛分枝杆菌检测的敏感性和特异性。特异性是准确检测目的病原的必要条件，通过比较发现，3号引物在检测时，杂带较多，易干扰检测结果；1号引物均能检测出牛分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌，仅可用于分枝杆菌群的检测；2号和4号引物均能够特异性检测牛分枝杆菌，可用于临床诊断牛结核病。此外，感染后不同阶段动物机体所携带的牛分枝杆菌不同，临床采集的不同样品之间存在一定差异，提取的核酸含量或高或低。因此，敏感性成为评价PCR检测方法的另一重要参数。在评价过程中，虽然1号引物检测牛的肺组织和淋巴结中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达1 CFU/mL，但其不能用于牛结核病的特异性诊断；2号引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度可达10-10ng/μL，对牛的肺组织和淋巴结中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达106和105CFU/mL，对牛奶中的牛分枝杆菌检测灵敏度可达106CFU/mL；4号引物虽然对牛的肺组织和淋巴结中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达105和106CFU/mL，对奶中的牛分枝杆菌检测灵敏度可达102CFU/mL，但是其对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度较低，仅为10-3ng/μL。因此，在牛结核病的病原学检测中，2号引物较适合于肉用牛肺组织和淋巴结的牛分枝杆菌和禽分枝杆菌的PCR检测，4号引物较适合于奶样中病原菌的PCR检测。

总之，本研究系统地优化了4种常见牛分枝杆菌特异性基因PCR检测体系，并比较分析了其特异性、敏感性、样品可适性等参数，对开展牧场结核病的检测和净化具有一定的参考价值。