黄芩苷碳点的制备表征及其对犬乳腺肿瘤细胞增殖的抑制作用

骆宗江，刘彪，林珈好

(1. 中国农业大学动物医学院，北京 100193；2. 中国农业大学中兽医药创新中心，北京 100193)

犬乳腺肿瘤(canine mammary tumour，CMT)是雌性犬最常见的肿瘤之一，占雌性犬肿瘤疾病的25%～42%[1]，其发病率是人类乳腺肿瘤的3倍[2-3]，严重威胁犬的健康。目前，手术切除是治疗CMT最常见的方式，然而，对于恶性乳腺肿瘤的患犬，单纯手术切除疗法对其创伤大，术后并发症多且容易复发或转移[4]。CMT在中兽医中属于“乳岩”范畴，其主要病因病机为肝郁气滞，瘀毒互结[5]，气滞血瘀、痰浊淤积，阻于乳络，久而生成癌毒。癌毒是乳腺肿瘤发生发展的关键，扶正祛邪、抗癌解毒是治疗乳腺肿瘤的重要治则[6]。黄芩是清热解毒中药，尤其擅长解痈肿疮毒，是治疗乳腺肿瘤的常用中药。黄芩苷(baicalin)是从黄芩干燥根中提取得到的黄酮类成分，为黄芩的主要活性成分。研究表明，黄芩苷能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导乳腺癌细胞凋亡，且具有时间和浓度依赖性[7]，但是黄芩苷存在水溶性差和生物利用度低的缺点，其临床应用受到限制，亟需寻找有效的解决方法。

碳点是一类粒径小于10 nm，主要元素为碳、氢、氧和氮的新型零维碳纳米材料[8]。中草药作为天然产物，其来源广泛，含有丰富的活性成分，是碳点合成的理想前体之一[9]。以中草药为碳源合成的中药碳点作为碳点家族的最新成员，具有水溶性好、毒性低及杂原子丰富等优点[10]，在生物成像[11]、抑菌[12]和肿瘤治疗[13]等生物医学领域得到了广泛的研究和应用。本研究以黄芩苷为碳源，制备黄芩苷碳点，并探究了其抗犬乳腺肿瘤的活性。

1 材料与方法

1.1 细胞

犬乳腺癌细胞系CIPp由日本东京大学兽医学院馈赠；CMT-7364由本实验室自临床分离、鉴定及保存[14]。

1.2 主要试剂

黄芩苷(纯度≥90%)，上海麦克林生化科技有限公司产品。

1.3 主要仪器

水热合成反应釜，西安仪创实验室仪器设备有限公司产品；真空干燥箱，上海精宏仪器设备有限公司产品；Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore公司产品；真空冷冻干燥仪，上海叶拓科技有限公司产品；紫外-可见分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；荧光分光光度计，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；傅里叶变换红外光谱仪，德国Sigma公司产品；场发射透射电镜，荷兰Philips-FEI公司产品；X射线光电子能谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；透析袋(1 000 Da)，北京索莱宝科技有限公司产品。

1.4 黄芩苷碳点的制备

将20 mg黄芩苷粉末与30 mL超纯水混合均匀后，转移至水热合成反应釜，随后将其置于真空干燥箱中，反应温度设为160 ℃，持续6 h。反应结束后，待反应釜自然冷却至室温，取出溶液，12 000g离心30 min，收集上清液，用0.22 μm滤膜过滤，取滤液透析24 h。最后，使用真空冷冻干燥仪对透析后的液体进行冷冻干燥[13-15]。

1.5 黄芩苷碳点的表征

1.5.1 黄芩苷碳点形态观察

将制得的黄芩苷碳点配制成碳点水溶液，将碳点水溶液滴于超薄碳膜，待干燥后在高分辨率透射电子显微镜下观察碳点的大小和形态。

1.5.2 黄芩苷碳点的紫外可见吸收光谱分析

将黄芩苷碳点配制成的碳点溶液置于紫外-可见分光光度计中，扫描检测其250～700 nm的吸收图谱。

1.5.3 黄芩苷碳点的荧光发射光谱分析

将黄芩苷碳点配制成的碳点溶液置于荧光光谱仪中，用380～480 nm波长的光激发，扫描并记录黄芩苷碳点在不同激发波长下的发射光谱。

1.5.4 黄芩苷碳点的红外光谱分析

将碳点样品置于傅利叶红外光谱仪中进行红外扫描，波数范围为500 ～4 000 cm-1，记录红外谱图，分析碳点的表面结构。

1.6 黄芩苷碳点对犬乳腺肿瘤细胞的增殖抑制作用

将犬乳腺肿瘤细胞CIPp、CMT-7364培养于含10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素链霉素的DMEM完全培养基中，将培养皿置于37 ℃，5% CO2恒温箱中培养。取处于对数生长期的CIPp和CMT-7364细胞系按照1.0×104个/μL接种于96孔板，为减少挥发，在96孔细胞板四周的孔中加入100 μL PBS，不接种细胞。待细胞贴壁后，弃去旧培养液，分别加入100 μL含有不同浓度黄芩苷碳点的完全培养基。共孵育48 h后，弃去原培养基，分别加入100 μL含10% CCK-8试剂的DMEM，37 ℃避光孵育30～60 min后，检测各孔在450 nm处的OD值，计算细胞存活率；用Graphpad Prism 8.0软件计算碳点溶液作用于两种细胞的IC50值。

细胞存活率=(OD试验-OD对照)/(OD对照-OD空白)×100%。

2 结果

2.1 黄芩苷碳点形态观察

如图1所示，黄芩苷碳点呈类球形，颗粒较均匀且分散性良好，颗粒的平均直径为3～6 nm，晶格间距为0.253 nm。

A.透射电子显微镜成像；B. 高分辨率透射电子显微镜成像。

2.2 黄芩苷碳点的紫外可见吸收光谱分析

黄芩苷碳点水溶液在自然光照下呈黄色，在365 nm紫外光下发出蓝色荧光。由紫外可见吸收光谱(图2)可知，黄芩苷碳点在260 nm及350 nm附近存在吸收峰。

图2 黄芩苷碳点的紫外可见吸收光谱

2.3 黄芩苷碳点的荧光发射光谱分析

荧光发射光谱(图3)显示，黄芩苷碳点的发射波长随着激发波长的增加逐渐红移，说明该碳点具有较好的荧光激发依赖特性。

图3 黄芩苷碳点的荧光发射光谱

2.4 黄芩苷碳点的红外光谱分析

如图4所示，在黄芩苷碳点的红外光谱中，3 432 cm-1附近的吸收峰归因于O-H的伸缩振动，1 716 cm-1处吸收峰由C=O伸缩振动产生，1 450 cm-1处的吸收峰对应N-H的伸缩振动，1 099 cm-1附近的吸收峰归因于C-O的伸缩振动。结果表明，黄芩苷碳点表面存在-OH、-COOH和-NH2等基团，提示该碳点具有较好的水溶性。

图4 黄芩苷碳点的红外光谱

2.5 黄芩苷碳点对犬乳腺肿瘤细胞增殖的抑制作用

如图5所示，黄芩苷碳点作用犬乳腺肿瘤细胞CIPp、CMT-7364 48 h的IC50分别为41.65 μg/mL和42.78 μg/mL，表明黄芩苷碳点可有效抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖。

A.犬乳腺肿瘤细胞CIPp；B. 犬乳腺肿瘤细胞CMT-7364。

3 讨论

水溶性是药物发挥作用的关键性质，水溶性的增加可增强药物在体内的溶解及吸收，从而改善药物的生物利用度。本研究红外图谱显示，黄芩苷碳点在3 432 cm-1、1 716 cm-1和1 450 cm-1附近出现吸收峰，分别归因于O-H、C=O和N-H的伸缩振动，提示该碳点表面存在-OH、-COOH和-NH2等基团，表明黄芩苷在制成碳点后可获得良好的水溶性，从而发挥更优的疗效。

无限增殖是恶性肿瘤的显著特征之一，它可导致肿瘤组织的过度生长，从而掠夺正常组织的营养和生存空间，影响机体正常的生理功能，最终严重威胁到个体的生命健康[16]。药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用是考察其抗肿瘤活性的重要评价指标。CCK-8试验结果显示，黄芩苷碳点能够有效抑制犬乳腺肿瘤细胞CIPp和CMT-7364的增殖，这与之前的报道相似。Yao等[13]基于人参皂苷Re成功合成出一种新型光致发光碳点，并对其体外抗癌作用进行评估，结果表明该碳点可抑制肿瘤细胞的增殖，并通过caspase介导的途径诱导肿瘤细胞凋亡。Li等[17]发现用生姜制成的碳点能够极显著地抑制人肝癌细胞HepG2的生长，且对正常乳腺上皮细胞MCF-10A和小鼠肝细胞FL83B的毒性较低。

本研究以黄芩苷作为碳源，采用水热法成功制备出粒径小于10 nm的黄芩苷碳点，发现该碳点不仅具有良好的水溶性，且能够有效抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖，可为抗犬乳腺肿瘤中药的创制提供试验依据。然而，黄芩苷碳点作为一种新型零维碳纳米材料，其成药性还需进一步探究，如增设阳性药物对照组、采用正常细胞系进行试验以及在犬乳腺肿瘤在体模型上进一步验证等。