荷叶碱改善高脂饮食诱导比格犬肥胖的试验研究

卢炜，刘超，卢劲晔，陆江*

(1. 江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏 泰州 225300；2. 江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，江苏 泰州 225300)

肥胖是一种全球流行的代谢病，可降低人类生活质量，缩短平均寿命[1]。肥胖的特征主要包括皮下脂肪组织和内脏器官中过量的脂肪积累以及高血脂，而且肥胖还可增加许多慢性疾病的风险，特别是2型糖尿病、心血管疾病和肝脏疾病等[2]。目前，我国成年居民的超重和肥胖率超过50%，呈现持续上升趋势[3]。肥胖的预防和治疗已经成为一个重大的公共卫生问题。相似地，肥胖也成为犬最常见的代谢性疾病之一，近年来发病率不断升高，成为宠物行业关注的热点问题。然而，现有减肥药的疗效有限，并可能出现严重的副作用[4]，预防治疗肥胖的新策略仍然是当前领域的研究热点。

近年来，中草药由于具有疗效确切、毒副作用少等优势已被广泛用于肥胖的防治[5]。国家市场监督管理总局规定了50多种药食同源的中药可作为具减肥功能保健品的原料药。荷叶是一种药食同源的中药，除了具有清心解暑、活血化瘀、凉血止血、升发清阳、消风祛湿等功效，还具有减肥降脂作用[6]。荷叶碱(nuciferine，NUC)是从荷叶中获得的一种含芳香环的生物碱，是荷叶发挥减肥降脂作用的主要活性成分[7]。然而，NUC水溶解性小，口服生物利用度低，现有大量研究中常使用助溶剂来提高其生物利用度，相关直接口服NUC的试验研究较少，不方便NUC相关饮食产品的开发。本试验以比格犬为动物模型，研究了饲料中直接添加不同剂量NUC对高脂饮食犬的影响，以评估NUC的安全性和抗肥胖效果，从而为NUC的相关抗肥胖产品开发提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

36只比格犬，雄性，3岁，体重10 kg左右购于江苏泰斯特生物科技有限公司，实验动物生产许可证SCXK(苏)2021-0010。

1.2 主要试剂

荷叶碱(纯度>98%)，购于Med Chem Express公司。

1.3 试验设计

36只比格犬以正常饲粮进行适应性饲喂2周后，随机等分为6组：正常饲粮组(NCD组)、含0.1% NUC正常饲粮组(ND+NUC组)、高脂饲粮组(HFD组)、含0.05% NUC高脂饲粮组(HFD+0.05% NUC组)、0.1% NUC高脂饲粮组(HFD+0.1% NUC组)和0.15% NUC高脂饲粮组(HFD+0.15% NUC组)。然后，各组分别饲喂各自饲粮，试验期为8周。整个试验过程中，所有犬均单笼饲养于环境温度为(25±2)℃、室内湿度为60%左右的动物房中，每天8：30和16：30各饲喂1次，每次进食15 min，自由饮水。正常饲粮参考《犬营养标准》(NRC—2016)配制，各组饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮的组成及营养水平(风干基础) %

1.4 体重与采食量测定

试验前与试验后分别称量体重。每天观察记录采食情况，计算每天采食量，试验结束时计算平均日采食量。

1.5 皮下脂肪厚度测定

参考郭世洪[8]的方法，在试验结束时，使用超声诊断仪(型号：MyLab 9，意大利Esaote公司)，采用7.5 MHZ线阵探头，对犬腹部脐孔后方进行扇形移动扫描，根据B超影像测量皮下脂肪厚度，连续测量3次取平均值。

1.6 血液样本采集与指标测定

试验结束时，空腹采集各组犬的头静脉血液，一部分直接放于-80 ℃保存，另一部分在4 ℃下3 000 r·min-1离心15 min得到血清，-80 ℃保存。使用动物血球分析仪(IDEXX Laboratories，Inc.美国)测定血常规，使用动物生化分析仪(IDEXX Laboratories，Inc.美国)测定血液生化指标，使用动物血气分析仪(南京普朗医疗设备有限公司)测定血中电解质含量，所有检测均用仪器自带试剂盒并按操作说明进行。

1.7 皮下脂肪组织HE染色

使用舒泰麻醉后，立即切取腹股沟脂肪组织，置于-80 ℃保存备用。苏木精-伊红(HE)染色主要操作如下：将收集的部分腹股沟脂肪组织样本迅速解冻后用4%多聚甲醛在4 ℃下过夜固定，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，然后用HE染色，在显微镜(奥林巴斯，日本)下观察并获取图像。用Image J软件测量脂肪细胞大小，并以每2 000 μm2脂肪细胞面积为间隔点，计算各面积区域内的脂肪细胞比例。

1.8 数据处理

数据以平均数±标准差表示，采用SPSS 23.0软件单因素方差分析，然后用Tukey检验进行差异性分析。P<0.05，表示统计学差异显著，P<0.01，表示统计学差异极显著。

2 结果

2.1 荷叶碱对高脂饮食犬体重体脂和采食量的影响

从表2可知，各组间的平均采食量无显著差异；与NCD组比较，NCD+0.1% NUC组的初始体重、终末体重、体重增量及皮下脂肪厚度均无显著变化，而HFD组终末体重、体重增量及皮下脂肪厚度均显著升高(P<0.05)；与HFD组比较，HFD+0.1% NUC组和HFD+0.15% NUC组的终末体重、体重增量及皮下脂肪厚度均显著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC组体重增量显著降低(P<0.05)。

表2 各组间体重、采食量和皮下脂肪厚度的比较

2.2 荷叶碱对高脂饮食犬血球指标的影响

从表3可知，各组间的血常规参数无显著差异，且均在正常参考范围内，这表明添加荷叶碱对犬血常规无影响。

表3 各组间血常规参数的比较

2.3 荷叶碱对高脂饮食犬血清生化指标的影响

从表4可知，与NCD组比较，HFD组血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等血脂指标升高(P<0.05)，总胆红素(TBIL)和碱性磷酸酶(ALT)等指标显著升高(P<0.05)。与HFD组比较，HFD+0.1% NUC组的TG、LDL-C、TBIL和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平显著降低(P<0.05)，HFD+0.15% NUC组的TG和LDL-C显著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC组的血液生化指标无显著变化(P>0.05)。

表4 各组间血液生化指标的比较

2.4 荷叶碱对高脂饮食犬血中电解质的影响

从表5可知，各组间的血液中氯、钠、钾、钙和磷等电解质水平无显著差异。

表5 各组间血液电解质指标的比较 mmol/L

2.5 荷叶碱对高脂饮食犬脂肪组织的影响

各组脂肪细胞大小和分布比较结果见图1。

腹股沟脂肪组织的HE染色结果显示，在相同视野内，与NCD组比较，HFD组脂肪细胞数量较少，细胞扩张，添加不同剂量NUC可使脂肪细胞面积变小及数量增加(图1A)。HFD组脂肪细胞面积分别高于NCD组和NCD+0.1% NUC组，HFD+0.1% NUC组、HFD+0.15% NUC组脂肪细胞面积低于HFD组和NCD+0.05% NUC组(图1B)。NCD组和NCD+0.1% NUC组中，面积小于2 000 μm2脂肪细胞的比例达80%，HFD组中的脂肪细胞(S>2 000 μm2)的比例约为75%，HFD+0.1% NUC组和HFD+0.15% NUC组中脂肪细胞(S>2 000 μm2)的比例约为40%(图1C)。

A.脂肪组织HE染色代；B.脂肪细胞大小比较；C.不同面积区间的脂肪细胞分布情况。##P<0.01。

3 讨论

肥胖是由于机体长期能量摄入大于消耗，导致过剩的能量以甘油三酯形式堆积与脂肪组织的一种慢性代谢性疾病[9]。饮食结构的改变与肥胖关系密切，高能高脂饮食是肥胖的主要病因[10]。因此，高脂饮食已经成功广泛应用于各种动物肥胖模型的制备[11-13]。本试验结果显示，HFD组比格犬的体重、皮下脂肪厚度及血脂水平均高于NCD组，提示肥胖模型建立成功。而NUC能够有效改善这些病理症状，表明直接补充NUC对肥胖防治具有积极作用。

脂肪组织具有能量维持能力和储存能力，脂肪组织中脂肪含量的平衡与脂肪形成和脂解这两个相反的过程有关[14]。在多种因素(如过多能量摄入)引起正能量平衡时，脂肪细胞可通过增加细胞数量(脂肪形成)和细胞内脂质含量(肥大)促进脂肪组织病理性扩增，最终导致肥胖[15-16]。脂肪形成主要受过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白家族(C/EBP)调节[17]；脂解主要由脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)参与的将甘油三酯水解为脂肪酸和甘油，以满足身体能量需求的一种脂肪代谢途径，脂解激活可减少脂肪组织中存储的脂肪含量[18]。因此，一种能够调节这两个过程的天然化合物可能会极大改善肥胖患者脂肪组织中的脂肪积累。刘晓琴等[19]研究表明荷叶生物碱能够抑制前脂肪细胞3T3-L1生长，提示荷叶生物碱能够抑制脂肪形成。张丽静等[20]研究表明荷叶碱能够通过增加脂肪酶活性促进脂解代谢改善C57小鼠高脂血症。药动学研究表明，荷叶碱药物动力学体内过程具有显著的种属差异性，在比格犬体内吸收少且代谢快，这可能影响NUC生物利用度和药效[21]。本研究结果显示，高脂饮食可引起犬皮下脂肪组织扩张和脂肪细胞肥大，补充0.1% NUC和0.15% NUC均可减轻高脂饮食引起犬脂肪细胞肥大，提示在0.1%和0.15%剂量下NUC的抗肥胖作用不受其药动学影响。

长期摄入高脂食物容易引起机体内脂质代谢的紊乱，从而引起肝细胞损伤[22]。血中TBIL和ALT是临床上常用的肝功能生化指标，两者含量升高往往提示肝功能受损。本研究中，HFD组的TBIL和ALT水平高于NCD组，补充0.1% NUC可降低TBIL和ALT水平，这提示0.1% NUC能够改善高脂饮食引起的肝酶变化。然而补充0.15% NUC没有这一作用，其具体原因还需进一步研究。此外，补充NUC对比格犬血球参数和电解质无影响。

对于人类而言，临床上常用减肥药物及手术等方法治疗肥胖，但是对于肥胖犬猫而言，由于各种因素的限制，兽医临床上很少采用减肥药物或手术减肥。美国曾推出过两种通过抑制食欲来达到减肥效果的针对宠物犬猫减肥的处方药，但宠物市场中并未受到广泛接受，目前已撤出宠物市场。 宠物减肥处方粮经济实惠，操作方便，效果优良，可能会成为宠物减肥的新方向。本研究发现，在饲料中直接添加荷叶碱可以有效减轻高脂饮食诱导肥胖犬的体重和皮下脂肪堆积，这表明荷叶碱可直接作为功能性饲料添加剂用于防治犬的肥胖症，绿色安全有效，为宠物犬抗肥胖处方粮的研制提供新思路。

综上，补充NUC对高脂饮食犬具有抗肥胖作用，无安全问题，其中0.1% NUC效果最佳。