弓形虫529重复序列检测方法的比较

殷位刚，朱银银，2，杨佩才，张洪英，2*

(1. 南京医科大学附属南京疾病预防控制中心，江苏 南京 210003；2. 南京医科大学公共卫生学院，江苏 南京 211166)

弓形虫又称刚地弓形虫，是一种人畜共患的细胞内原生动物，广泛存在于全球各地，可寄生于几乎所有温血动物[1]。作为一种人畜共患寄生原虫，弓形虫因其在医学和兽医学上的重要性而受到广泛研究。弓形虫可通过粪口途经或经胎盘传播。作为终末宿主，猫科动物是唯一已知的存在弓形虫有性繁殖阶段并将感染性卵囊释放到环境中，而弓形虫的三个阶段，速殖子、缓殖子和卵囊对所有宿主都具有传染性。人、猫等温血动物，作为中间宿主消化卵囊时，卵囊变为速殖子进入快速复制阶段形成急性感染，引起弓形虫病。因为免疫系统不会消除速殖子，其中一些进入缓慢生长阶段的慢殖子储存在中间宿主的大脑、肌肉、心脏和其他组织中[1-3]。

弓形虫病是最常见的人畜共患疾病，影响到世界三分之一的人口，并造成世界范围内的重大公共卫生问题[1-3]。目前报道的，用于弓形虫感染的全球监测技术可分为非DNA型和DNA型。非DNA检测包括血清学测试，如染色测试(DT)、间接荧光抗体测试(IFAT)、乳胶凝集试验(LAT)、改良凝集试验(mend agglutination test，MAT)、间接血凝试验(indirect hem agglutina-tion test，IHA)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。基于DNA的检测包括常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)[2-4]。非DNA检测方法中抗体检测不能区分既往感染和当前感染；病原形态学检测虽然能区分既往感染和当前正在感染，但需要对弓形虫卵囊等形态学测试熟悉的专业人员，而且操作较为复杂。DNA检测方法具有快速和操作简单的特点，使现场快速检测成为可能[2-4]。

第一种检测弓形虫DNA的PCR方法，是1989年建立的靶向于B1基因[5]。据报道弓形虫529重复序列(Rep-529)，重复次数为10至100次，故靶标Rep-529比无重复的B1基因更敏感[6-7]。多拷贝ITS-1和18S rDNA也被用作一些研究中的靶标，显示出类似于B1基因的敏感性[8-10]。经过优化和改良的套式PCR进一步提高了检测灵敏度和特异性，靶标Rep-529的检测限低于B1的8 000倍，为640 fg DNA，而B1套式PCR的检测限为5.12 pg[11]。总之，目前的报道表明，针对Rep-529重复片段的DNA检测最敏感。

本研究比较了针对弓形虫Rep-529的qPCR和LAMP检测法，筛选出较优检测方法，并初步应用于宠物猫粪便中弓形虫卵囊DNA检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

美国MP公司的土壤微生物基因组抽提试剂盒(FastDNATMSPIN KIT，6560-200)，均质器(FastPrep-16)购自美国；探针法荧光定量PCR预混液(QN114、QV113)购自南京诺维赞生物科技有限公司；GspSSD 2.0等温Master mix试剂盒购自英国Optigene公司。Genie Ⅱ等温扩增荧光检测系统及相配套的软件系统Genie Explorer为英国Optigene公司产品；QuantStudioTM5实时荧光定量 PCR 系统系美国ABI公司产品。

1.2 引物设计

本研究选择Rep-529基因片段(GenBank登录号DQ779189)作为靶基因，分别设计相应的引物，见表1。所有引物、探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物探针序列和靶标

1.3 Rep-529质粒合成

将含有Rep-529的弓形虫基因片段构建至pUC18载体上，经过测序比对序列与DQ779189的相应片段完全一致，质粒转化的甘油菌在对数生长期收集，用天根质粒DNA提取试剂盒进行质粒DNA提取。Qubit 3.0 测定质粒质量浓度。按照以下公式计算质粒拷贝浓度，该质粒作为阳性对照。

拷贝浓度(copies/μL)=(6.02 ×1023×质量浓度× 10-9)/(DNA 长度×660)

=(6.02×1023×35.3×10-9)/(3 218×660)

=1×1010copies/μL。

1.4 反应体系和程序

1.4.1 qPCR反应体系和程序

反应体系：10 μL 2×探针法荧光定量PCR预混液(QN114或QV113)，0.6 μL 正、反向引物TGF和TGR(10 μmol/L)，0.8 μL引物探针TG-Probe(5 μmol/L)，5 μL DNA模板，最后加无酶水补齐至总反应体积20 μL。

反应程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 50 s，40个循环。

1.4.2 LAMP反应体系和程序

反应体系：15 μL GspSSD 2.0 等温Mastermix，5 μL LAMP引物混合液(FIP∶BIP∶F3∶B3∶LF∶LB=1.6 μmol/L∶1.6 μmol/L∶0.8 μmol/L∶0.8 μmol/L∶0.4 μmol/L∶0.4 μmol/L)和5 μL DNA模板。

反应程序：LAMP-2021、LAMP-529-11和LAMP-5293均为65 ℃，1 h ；LAMP-RE为63 ℃，1 h。

1.5 检测限比较

用梯度稀释的质粒作为模板，各取5 μL不同浓度的重组质粒进行qPCR和 LAMP 检测，确定两种方法的检测限，以无菌水作阴性对照。

1.6 交叉反应测试

用实验室保存的隐孢子虫、贾第鞭毛虫和旋毛虫DNA以及大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、细小病毒DNA作为模板，进行扩增，同时以质粒阳性对照和无酶水作阴性对照。

1.7 样本检测

39只来自南京市家猫，随机收集沙盘中猫粪，或者采肛拭子，每只猫用一套采样工具，一个干净采样袋，袋装后封条密闭，分别编号，当天检测。

仔细将猫砂与粪便分离，取粪便或者肛拭子进行DNA提取。同时以无酶水作为提取过程阴性对照，经过镜检无任何可疑原虫样虫卵或者卵囊的猫粪DNA作为样本DNA阴性对照。采用美国MP公司的土壤微生物基因组抽提试剂盒(FastDNATMSPIN KIT，6560-200)提取总DNA并纯化，最后加100 μL洗脱液洗脱DNA待检[15]。

1.8 统计分析

使用SPSS 26.0软件进行数据录入、计算和相关性分析。方法学以最小检出限或者相关性进行描述，各方法的临床样本检测效果用百分比进行描述性表达。检出率比较用卡方检验，P<0.05为有统计学差异性。

2 结果

2.1 等温扩增检测限比较

本研究合成Rep-529质粒用于4种LAMP的最低检测限比较。等温扩增529-11组检测限最低，为103copies/μL(图1A)，其次为文献报道的RE引物组，检测限为104copies/μL(图1B)，529-3(图1C)和2021(图1D)引物组的检测限最高，均为105copies/μL。

A. LAMP-529-11；B. LAMP-RE；C. LAMP-529-3；D. LAMP-2021。

A. QN114；B. QV113。

2.2 qPCR检测限测试及线性范围计算

以Rep-529为靶标的qPCR(TGP)是文献报道的引物探针(表1)，本研究对比了QN114和QV113两种qPCR体系，二者均可以检出104copies/μL，但103copies/μL检测Ct值与阴性水对照结果无差异，即最低检测限为104copies/μL。图2表明二者均在104～106copies/μL之间获得较好的线性检测关系，为线性检测范围(图2)。以QN114体系的梯度相关性(R2=0.991 8)稍优于QV113体系的梯度相关性(R2=0.983 4)。

2.3 交叉反应测试

以保存的病原DNA作为模板，进行扩增，同时设定质粒阳性对照和水阴性对照。结果显示，加了隐孢子虫、贾第鞭毛虫、旋毛虫、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或细小病毒DNA的扩增与水对照一致，说明隐孢子虫、贾第鞭毛虫、旋毛虫、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或细小病毒DNA没有额外的扩增，即没有交叉反应。

2.4 样本检测

以检测限最低的LAMP法529-11引物组进行样本检测。以镜检阴性的猫粪和无酶水提取的DNA扩增结果一致。对南京市39只家猫粪便或者肛拭子进行检测，29份粪便中检测出11份阳性(37.93%，11/29)；10份肛拭子中检测出2份阳性(20.00%，2/10)，总检出率为33.33%(13/39)。本研究中，39只家猫，有29份为沙盘中的粪便，分量充足，符合样本检测要求。但是，有10份肛拭子样本，与粪便相比，分量较少，有的不足500 mg。粪便和肛拭子检出率卡方检验进行统计学比较发现，二者无统计学差异(P=0.445)(表2)。

表2 LAMP-529-11对南京市宠物猫弓形虫DNA的检测结果

3 讨论

目前，估计全球有200万人感染弓形虫[16]。感染途径是通过食用含有弓形虫速殖子、缓殖子的生肉或未煮熟的肉，摄入被卵囊污染的食物或水，或直接接触猫粪便中脱落的卵囊。由于随着猫的数量不断增加，这可能会给人类以及其他动物带来显著的暴露风险。野生动物临床弓形虫病病例已发现的有兔、松鼠、金丝雀、狐狸、鹿、熊、浣熊、狐猴、松鼠、猴子以及狨等[17]。

本研究以Rep-529重复片段为靶标进行LAMP引物组的筛选。结果表明，等温扩增529-11引物组检测限最低，为103copies/μL，其次为文献报道的RE引物组[13-14]和qPCR引物组[12]，检测限为104copies/μL，529-3引物组和2021引物组的检测限最高，均为105copies/μL。各引物组对隐孢子虫、贾第鞭毛虫、旋毛虫、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、细小病毒DNA均无交叉反应，表明均具备弓形虫DNA检测特异性。此外，LAMP 529-11引物组对镜检阴性的猫粪DNA也无交叉反应，进一步表明该方法具备Rep-529 DNA检测特异性。用该引物组对南京市家养宠物猫的粪便或者肛拭子中弓形虫Rep-529 DNA进行检测，宠物猫29份粪便中检出11份阳性(37.93%，11/29)；10份肛拭子中检出2份阳性(20.00%，2/10)，总检出率为33.33%(13/39)。该感染率远远高于文献报道的其他动物的弓形虫感染率。李珂等[18]检测云南省家禽中弓形虫抗体阳性率为4.48%；李培德等[19]检测温州市犬弓形虫抗体阳性率为13.39%；刘丽娅等[20]检测乌鲁木齐地区犬弓形虫病血清抗体阳性率介于7%～25%之间；蔡为民等[21]在扬州地区山羊未发现弓形虫感染；陈小丽[22]发现，福州动物园圈养野生动物12种(21只)哺乳动物感染弓形虫；陈晓雨等[23]报道上海和广东猪肉中弓形虫检出率为4.07%，上海地区检出率(6.32%)显著高于广东(1.37%)。

本研究在LAMP引物组中筛选出529-11为检出限最低引物组，但是LAMP引物组均未获得检测时间与质粒模板梯度之间较好的线性关系(结果未展示)。虽然文献报道的qPCR检出限高10倍，但获得较好的线性范围(图2)，说明本研究的扩增体系下，qPCR有较好的定量关系，可以在线性范围内对弓形虫DNA进行定量检测。若用LAMP进行定量检测，还需进一步对扩增体系进行优化。

本研究的不足之处：其一为检测样本数量不多；其二为没有检测流浪猫的弓形虫感染情况。将来有条件还可以扩大样本量进行更大范围的检测。在有限数量的检测中，用本研究筛选的LAMP法在南京市宠物猫中已发现有33.33%的猫在排出卵囊，对环境和人类有较大的潜在污染和传染风险。虽然宠物猫接种疫苗的比率很高，但是仍然有比较高的弓形虫感染率，这可能与多方面因素有关。其一，猫既是弓形虫的终末宿主，又是中间宿主，自身可以形成完整的生活史，也就是说，猫感染了弓形虫，排出卵囊，污染环境，还会反复感染；其二，几乎所有的脊椎动物都是弓形虫的中间宿主，如果猫排出的卵囊污染了环境，人和其他动物被感染，如老鼠等，这些动物又被猫食入，猫再次被感染；其三，猫排出的卵囊污染猫的食物，猫食用被污染的食物后再次发生感染。本研究的样本进行饱和盐水或者糖水漂浮后也用传统镜检进行了检测，但是因为对弓形虫卵囊没有镜检经验，而且是当天检测，即使看到大小、结构疑似弓形虫卵囊的样本，仍不能确定。下一步将考虑进行必要的纯化或者孵育后进行孢子化卵囊的鉴定。

综上，本研究筛选获得靶向Rep-529重复片段的529-11引物组为快速、敏感、特异的LAMP引物组，可以在30 min内有效对粪便中弓形虫卵囊DNA进行等温扩增。本次检测家猫感染率高达33.33%，应引起足够重视。