高灵敏 HBV DNA 试剂定量下限与检测下限误用可能影响慢性HBV感染的正确诊疗

肖丽 彭海林 王蔚 薛荣荣 官正喜 咸建春

慢性HBV感染仍是严重的公共卫生问题。及时启动抗病毒治疗是降低慢性HBV感染危害的主要方式。近年来抗病毒适应证不断扩大,低病毒血症(LLV)甚至极低病毒血症(VLLV)的临床意义越来越受到关注,且血清HBV DNA阳性作为自然史分期与启动抗病毒治疗的主要依据[1-3],准确定量血浆或血清中HBV DNA水平对于诊断HBV感染、指导治疗决策、评估预后、监测抗病毒治疗的病毒学应答和耐药性的发生至关重要[4]。国内外指南或共识均推荐高灵敏技术用于HBV DNA检测[1,2,4,5]。但通常所说的高灵敏HBV DNA检测术语在相关指南、共识及许多文献中的应用与解释并不规范或可能存在错误,影响这一方法在临床与研究中的准确应用。本文根据该技术的性能并结合临床实践与相关文献阐述其相关术语可能存在的误用现象及正确应用的重要性。

一、高灵敏HBV DNA检测方法有多种,检测下限多在2.1～9.0 IU/mL

在我国,高灵敏HBV DNA检测主要针对长期广泛使用的HBV DNA定量检测试剂灵敏度相对较低(也称为“普敏”)而言。从术语命名考虑,除常用的“高灵敏”外,尚有“高精度”等[6];从定量单位考虑,既往常用“拷贝/mL”,目前多应用“IU/mL”,大约5拷贝/mL相当于1 IU/mL[7]。一般认为,相对于普通的HBV DNA检测,高灵敏HBV DNA检测具有更低的检测下限和较广的线性范围[8]。其中的“更低”和“较广”也是相对的概念,并无严格的界定。检测下限(LLOD或LOD)有时也用来表示“灵敏度(sensitivity)”,是指样品中的被分析物能被以适当方法与概率(95%以上[9])检测到但又难以精确量化的最低值或最低检出限。因为其定义更精确、使用频率更高,所以被认为是评价检测能力的首选术语[9,10]。定量下限(LLOQ)也被称为“测量范围的下限(lower end of the measuring range)”,是指样品中的被分析物能够在特定的实验条件下被定量测定的最低量,其检测结果具有可接受的准确度和真实性[10],是结果符合试剂准确度要求的最低病毒水平[9]。可以对分析物的浓度直接检测测量(定量)分析的范围的值为线性范围,通常其低限为LLOQ,高限为定量上限(ULOQ)。国内常用的普通HBV DNA检测的LLOQ多为100～500 IU/mL,高灵敏HBV DNA检测的LLOQ可低至10～26 IU/mL,ULOQ为108～109IU/mL,而其LLOD可低至2.1～9.0 IU/mL,甚至更低[11]。如Abbott实时PCR检测LLOD可达1.48 IU/mL[12]。上述性能参数给定的数值或范围一般由制造商根据有关指南设定,相互之间的关系见图1。

与高灵敏HBV DNA检测相关的分子技术包括实时荧光定量PCR、转录介导的扩增(TMA)、环介导等温扩增(LAMP)和滚环扩增(RCA)等,以PCR技术为主[13]。虽然不同检测方法在标本用量、LLOD、LLOQ、线性范围、循环所需时间、引物和探针所靶向的病毒区域稍有不同,但经对比研究,总体一致性良好,均具有灵敏度高、特异性强、线性范围广、基因包容性好以及快速、可重复、准确的特点,其相关术语、检测结果及其报告方式相互之间也较统一[11,14-17]。但具体应用时应注意检测方法及适用的平台/系统可能导致结果的适度差异。临床应用较广泛的HBV DNA检测方法的性能见表1(主要根据相关检测方法说明书)。

表1 部分高灵敏HBV DNA检测试剂性能参数对比

二、检测结果的报告类型有四种,检测到病毒但“低于定量下限者”易被误解为HBV DNA阴性

表2 不同检测结果的报告方式及解读

三、“定量下限”常被用作“检测下限”或“参考下限”

HBV DNA检测的LLOD与LLOQ是不同的,但LLOQ常常被误标为LLOD,这种现象不仅出现于一般文献中[2,3,16,20-28],甚至也出现于指南/共识中[2,28,29]。其中对灵敏度(sensitivity)理解也可能存在错误,因为检测的灵敏度对应于LLOD,而不是LLOQ。对于检验来说灵敏度尚可分为分析灵敏度、功能灵敏度,其中分析灵敏度对应于LLOD,功能灵敏度对应于LLOQ[10]。由于将LLOD误标为LLOQ,以致在同一文献中出现方法与结果的矛盾,如有研究文中标注其灵敏度为20 IU/mL,但从研究样本中检测出10～20、< 10 IU/mL的阳性结果[27]。以上误标在我国指南(2022年版)[1]已加以注意并作相应修改,Ortonne 等[11]及Yan等[16]在其相关文献中也对此有所区别。近期发布的《乙型肝炎病毒标志物临床应用专家共识》[30]虽然将灵敏度对应于LLOD,但其标定的滴度值仍可能是LLOQ,值得临床学习或应用时加以注意。因为在常用进口与国产检测方法中,LLOD多数已经≤ 10 IU/mL,见表1。

“定量下限”误用为“检测下限”不仅可能与医技、临床科室重视不够有关,也可能与有些检测公司长期以来所发报告的错误标注与解释不严谨有关。如在某公司的报告中,将本是LLOQ的“10 IU/mL”标注为LLOD,并对检测结果“< 10 IU/mL”作出“检测到HBV DNA,但低于检测下限”的自相矛盾解释。此外,临床检验报告也有些模糊的标识,如只标“检测下限”、“参考区间”、“参考范围”、“参考值”等。

四、LLOQ作为LLOD对临床诊疗的可能影响

第一,因血清HBV DNA阳性已作为HBV感染自然史分期、临床诊断与启动抗病毒的重要依据[1,2],故若仅以≥LLOQ作为HBV DNA阳性的依据,则必然遗漏一部分检测到病毒但无法进行定量的HBV DNA阳性甚至需要治疗的感染者。第二,LLV的临床意义越来越受到关注,其定义的基本依据即是“检测到,但<2 000 IU/mL”[20],从严谨角度出发,检测到即应属“HBV DNA阳性”;若临床将LLOQ误标为LLOD,也将导致LLV的漏诊。第三,对隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)诊断的影响:OBI的血清学诊断定义为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性者的血液中检测到有复制能力的HBV DNA[28]。OBI血液中HBV DNA载量通常很低,当检测到时,浓度通常< 200 IU/mL(约1000拷贝/mL),其中至少90%以上OBI患者的血清中HBV DNA水平< 20 IU/mL[19],且血液学检测方法是其诊断的常用方法[28],故检测方法的灵敏度(LLOD)对OBI的诊断至关重要。同样的人群,检测方法的LLOD越低检出率越高,有些检出率不同则要归结于对LLOQ与LLOD的误用。若将LLOQ误解为LLOD,并将低于LLOQ判读为HBV DNA阴性,则必然导致OBI的漏诊[31]。第四,对“HBV DNA阳性”定义的影响。理论上只要血浆/血清中HBV DNA载量高于LLOD即可算检测到HBV DNA(>95%)[9,11],就应该是“HBV DNA阳性”,但由于目前对LLOD与LLOQ认识的模糊,“HBV DNA阳性”定义为“>LLOD”还是“>LLOQ”还没有明确统一的规定,因而,不同程度影响临床决策与文献资料的合并。

综上所述,随着2016年WHO提出“2030年消除病毒性肝炎作为公共卫生危害”的目标,国内外指南或共识对于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的适应证均已逐步放宽或简化,并有“只要HBV DNA阳性即开始抗病毒治疗”的趋势[1,4,32-34]。故高灵敏HBV DNA检测在准确定量血浆或血清中HBV DNA水平以达到有效管理HBV感染中起到关键作用。但若在临床科研与实践、相关文献中,将LLOQ误用为LLOD,则不仅可能降低HBV感染的诊断率与治疗率,影响研究结果的可靠性、准确性,也给文献阅读者获取知识带来障碍。故应重视并正确认识、理解高灵敏HBV DNA 检测的相关术语,同时,也建议对HBV DNA“阳性”、“检测到”等进行定义与统一,促进指南或共识建议及时准确的临床转化。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：肖丽:查找、分析文献,撰写初稿;彭海林:收集文献、文章撰写;王蔚、薛荣荣、官正喜:负责查找文献,审阅文稿; 咸建春:提出思路,负责审阅、修改文稿及最后定稿。