夹脊电针通过TLR4/NF-κB 信号通路干预神经根型颈椎病大鼠炎症机制的研究*

王智元 郑晓涵 杨旭霞 王文韬 谢 希 张筱尤 高 曦

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

颈椎病是一种以颈椎椎间盘退变为主要致病因素的疾病，临床上可出现颈背僵硬、疼痛、上肢放射性疼痛等伴随症状。按照其累及的周围组织结构不同，将其分为神经根型、颈型、脊髓型、交感神经型和椎动脉型5种类型［1］，其中神经根型占比最高［2］。中医对于神经根型颈椎病（CSR）的治疗方法有针灸、推拿、针刀、中药内服与外用等，其中电针疗法在临床较为常见。现代研究已经证实了电针对CSR 能够起到缓解疼痛，消除或减轻增生物压迫造成的炎症、水肿，改善颈椎周围微循环等作用［3］，但目前对于夹脊电针治疗CSR 的作用机制研究较少。本实验研究以CSR大鼠为研究对象，探讨夹脊电针对其的作用效应和消炎机制，以期为夹脊电针治疗CSR的临床运用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～7 周龄的SD 雄性大鼠，购自黑龙江中医药大学医学动物实验中心，体质量300～350 g，动物许可证号：SYXK（黑）2021-010。动物在黑龙江中医药大学医学动物实验中心饲养，温度（22±2）℃，湿度50%左右，12 h 循环照明，自由饮食摄水。实验过程遵照动物的使用及伦理学相关规定［4］。

1.2 试药与仪器

阿莫西林胶囊（通药制药集团股份有限公司，产品批号：221222）、大鼠白介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司）、大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司）、TLR4 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-1021R）、NF-κB p65 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-20159R）、TRAF6 抗体（武汉菲恩生物科技有限公司，货号FNab08921）、兔抗GAPDH 抗体［生工生物工程（上海）股份有限公司，货号D110016］、HRP 山羊抗兔IgG（H+L）（武汉三鹰生物技术有限公司，货号SA00001-2）。DNM-9602 酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）、一次性无菌针灸针（长春爱康医疗器械有限公司）、KWD-808Ⅰ型脉冲针灸治疗仪（常州英迪电子医疗器械有限公司）、TS-2000A多用脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、EPS300数显稳压稳流电泳仪（上海天能科技有限公司）、VM-300S 漩涡混匀仪（群安实验仪器有限公司）、VE-60 微型垂直槽多板灌胶器（上海天能科技有限公司）、ICEN-24R 台式高速冷冻离心机（杭州奥盛仪器有限公司）、MDB100C 金属浴（群安实验仪器有限公司）、DHP9162电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 分组与造模

将75 只SD 大鼠随机分为5 组：空白对照组、假手术组、模型组、针刺组和电针组，每组15 只。用化学诱导法［5］对模型组、针刺组和电针组构建CSR模型，假手术组不进行化学诱导仅手术。1）麻醉与固定：大鼠经腹腔注射麻醉后俯卧位（选用戊巴比妥钠30 mg/kg 腹腔注射）固定于操作台上，颈前部垫5 mL 注射器，以使颈椎后突便于操作。2）准备：致炎物选择在0.5%甲醛中浸泡24 h的定量滤纸片（1 mm×1 mm）。去除颈背部毛发，碘伏消毒（以T1～T2正中切口为中心消毒周围4～5 cm），然后铺盖无菌洞巾，显露T1～T2正中区域（T2为大鼠颈部第2 个高突点）。3）手术：以T1～T2正中切口，沿着棘突纵行切开皮肤和皮下组织（逐层切开），切口约2 cm，用手术刀钝性分离棘突两侧肌肉，拉钩拉开肌肉，钝性分离暴露棘突和右侧椎板，然后用显微持针钳咬去T1椎板，显露出右侧C8神经根，仔细分离神经根和周围组织（务必不能损伤神经），然后将甲醛滤纸片放在暴露的神经根腋下。假手术组仅显露C8神经根，而不放置甲醛滤纸片。逐层缝合，关闭切口，缝合中在切口均匀涂抹阿莫西林胶囊。最终术中死亡2 只，术后死亡3只，每组取12只。

1.4 干预方法

模型成功后，从第3 天开始各组大鼠予以干预。假手术组、模型组予捆绑15 min，每日1 次，持续10 d。针刺组俯卧位捆绑大鼠后，针刺部位消毒，使用一次性无菌针灸针针刺大鼠C7～T13 对颈夹脊穴，穴位定位参照大鼠穴位图谱［6］，得气后留针15 min，每日1次，持续10 d。电针组俯卧位捆绑大鼠后，取C7～T13 对颈夹脊穴，电针正负极左右交替联，疏密波，频率5 Hz，电流强度2.5 mA（以大鼠颈肌及前肢轻度抖动为度），每日1次，每次15 min，持续10 d。空白组不予干预。

1.5 观察指标

1.5.1 步态评分 结合Kawakami 与Dubuisson 法对大鼠由疼痛挛缩造成的步态障碍进行评估。从造模前1 d起每日评定，正常步态、足无畸形计为1分；受损伤足轻触玻璃台面、不持重或轻微持重、走时跛行或足内收蜷缩畸形计为2分；走动时不着台面计为3分。

1.5.2 抓杆法评定 手持一根一次性筷子，使其平行于地面并位于距地面0.5 m处。抓取大鼠，将大鼠双前爪置于杆上，令其充分抓握后使其悬吊于杆上，用秒表记录大鼠双前肢的抓杆时间。另外，将双前肢抓握能力相近者计为1 分；右前肢能抓握但抓握能力明显弱于左前肢者计为2分；右前肢无法抓握者计为3分。从造模前1 d起每日评定。

1.5.3 ELISA 法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含量大鼠经腹腔注射麻醉后仰卧位（选用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射）固定于操作台上，先自腹部动脉取血，而后取C8神经根。将血液静置2 h 后进行离心，抽取上层血清，用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，严格参照说明书进行，于450 nm 波长下读取光密度（OD）值，根据OD值计算上述检测因子含量。

1.5.4 Western blotting 法检测神经根组织中的TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 蛋白表达水平 取大鼠神经根组织，加入蛋白提取剂（RIPA 裂解缓冲液∶PMSF 蛋白酶抑制剂=100∶1）抽提神经根组织总蛋白，4 ℃离心机10 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA 法测定上清液总蛋白浓度，加入含溴酚蓝染料的上样缓冲液和RIPA 裂解缓冲液将总蛋白浓度调整至6 mg/mL，而后100 ℃金属浴加热变性5 min。用10%的SDSPAGE 电泳分离蛋白，而后用湿转法将蛋白转印至PVDE 膜上。用5%的脱脂牛奶在摇床上室温封闭2 h，加入TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱中过夜，TBST 洗膜5 次，每次8 min。用HRP 标记的二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，再次洗膜。将ECL 工作液均匀的滴加在膜上，避光孵育1 min，使用化学发光图像处理系统扫膜，将蛋白条带图像保存下来。

1.6 统计学处理

采用GraphPad Prism9.5.1 软件。计量资料均以（±s）表示，多组间比较符合正态分布采用单因素方差分析，不符合正态分布采用非参数秩和检验，组间差异比较采用Tukey's 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 模型评价

见表1、表2。造模3 d 后模型组、针刺组和电针组大鼠表现出倦卧少动等特征。造模后模型组、针刺组及电针组大鼠步态评分和大鼠抓杆评分相近（P＞0.05）。与空白组大鼠相比，模型组、针刺组和电针组大鼠的步态和抓杆评分受到较大影响（P＜0.01），而假手术组由于仅用显微持针钳咬去T1椎板，显露出右侧C8神经根，未进行化学诱导，故相较于模型组、针刺组及电针组，对大鼠步态和抓杆评分影响较小（P＞0.05）。

表1 各组大鼠步态评分比较（分，±s）

注：与空白组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05；与针刺组比较，△P ＜0.05。下同。

干预后1.00±0.00 1.08±0.28 2.33±0.48 1.63±0.58#1.13±0.34#△组 别空白组假手术组模型组针刺组电针组n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.17±0.38 2.50±0.51**2.59±0.50**2.67±0.48**

表2 各组大鼠抓杆评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠抓杆评分比较（分，±s）

组 别空白组假手术组模型组针刺组电针组n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.21±0.41 2.58±0.50**2.67±0.48**2.63±0.49**干预后1.00±0.00 1.04±0.20 2.17±0.48 1.58±0.50#1.17±0.38#△

2.2 各组大鼠步态评分比较

见表1。干预结束后模型组、针刺组和电针组的步态情况均有所好转（P＜0.05）。相较于模型组，经过干预后针刺组及电针组干预后大鼠步态显著好转（P＜0.05），且电针组大鼠步态好转情况更明显（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠抓杆评分比较

见表2。干预结束后模型组、针刺组和电针组的大鼠抓杆情况均有所好转（P＜0.05）。相较于模型组，经过干预后针刺组及电针组干预后大鼠抓杆情况显著好转（P＜0.05），且电针组大鼠抓杆情况好转情况更明显（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较

见表3。与空白组比较，假手术组大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量升高不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），与假手术组比较，模型组大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，针刺组和电针组大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均降低（P＜0.05）；相较于针刺组，电针组大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量显著降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

注：与假手术组比较，▲P ＜0.01。

组 别空白组假手术组模型组针刺组电针组TNF-α 204.35±56.33 211.39±46.78 384.91±17.09▲303.88±42.05#239.09±40.39#△n 12 12 12 12 12 IL-1β 25.79±3.75 28.92±3.83 47.02±4.19▲41.07±2.30#34.72±3.29#△IL-6 86.89±12.27 89.09±10.59 128.86±15.01▲111.82±13.07#95.09±6.0281#△

2.5 各组大鼠神经根组织TLR4、TRAF6、NF-κB p65蛋白表达比较

见图1。结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经根组织TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表达明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，针刺组和电针组大鼠神经根组织TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表达均降低（P＜0.01），且相较于针刺组，电针组大鼠神经根组织TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表达降低更明显（P＜0.01）。

图1 各组大鼠神经根组织TLR4、NF-κB p65、TRAF6 p65蛋白表达

3 讨 论

目前医学上对CSR 的病理机制虽然并未完全明确，但认为其主要与机械性压迫、炎性因子浸润或损伤对神经根的刺激以及疼痛等伤害性信息的传导密切相关［7］。王小云等［8］研究表明，椎间盘或神经根出现局部炎症反应，导致一氧化氮、白介素等炎性因子的浸润或损伤对神经根的刺激则是神经根产生疼痛进而引起肩臂痛的主要原因之一，但并未对炎性因子增多的机制进行探索。Tsukasa Onozawa 等［9］研究表明，在神经根受到损伤的过程中炎症因子产生的多种化学物质使中枢神经接受了大量伤害性信息，导致其敏感性增高，也是神经根疼痛的病因之一，但此研究并未涉及其相关炎症通路。因此积极探索与之相关的炎症通路与发生机制及高效的治疗方法，对临床治疗CSR 具有重要意义。

电针是指针刺得气后，在针上通以微弱的连续波或断续波，从而起到刺激穴位、治愈病症的目的。现代医学常用其治疗局部炎性改变。任祥等［10］的研究已经证实了电针对CSR 能够起到缓解疼痛，消除或减轻增生物压迫造成的炎症、水肿，改善颈椎周围微循环等作用。夹脊穴位于椎棘突下，后正中线旁开0.5 寸，刺激穴位有调节自主神经的作用。在临床常用于缓解疼痛。王勇等［11］的研究表明针刺夹脊穴在临床上能有效缓解CSR 患者的症状和体征，明显减轻CSR 患者的疼痛，但并未将其与电针相结合。本研究将电针与夹脊穴相结合，以期为临床提供新的思路。

现代研究证明TLR4/NF-κB 信号通路是免疫应答中起重要作用的炎症信号通路之一［12］。有研究［13］表明游离脂肪酸可以通过直接与TLR4 结合来激活髓样分化因子88（MyD88）依赖性途径，然后通过MyD88 和IL-1 受体相关激酶（IRAK）激活NF-κB，使NF-κB p65进入细胞核并转录激活下游炎症因子IL-6，触发免疫炎症反应。TRAF6是一种重要的NF-κB调节因素［14］，可以通过自身的泛素化修饰活化kappa B 抑制因子激酶（IKK）激酶转化生长因子激酶1（TAK1），TAK1 则可与TAB3 结合进而激活NF-κB 通路。TNF-α 为炎症反应的启动因子，生理状态下有助于增强免疫力和抑制肿瘤生长，但过度表达时可增大和加重炎症反应，引起多种病理损伤［15］。在CSR 发展期TNF-α 的含量与椎间盘的退变和疼痛呈正相关，TNF-α 能诱导NF-κB信号通路的活化，活化调节炎症反应的细胞因子IL-6的表达，增加炎症细胞的活性及聚集性［16］。且IL-1β也可以与IFN-γ 结合来驱动IL-6 的产生，促进机体免疫炎症进程［17］。所以通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路，减少IL-1β、IL-6、TNF-α 的产生与表达是缓解CSR炎性反应的重要机制。

本研究显示，使用夹脊电针干预可以显著改善CSR 大鼠的步态和抓杆情况，抑制了TLR4、TRAF6、NF-κB p65的蛋白表达，降低了IL-1β、IL-6、TNF-α的产生，缓解了CSR 大鼠的疼痛。研究将普通针刺组作为阳性对照，显示电针与普通针刺的作用机制相似，但电针对TLR4、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白表达的抑制和对IL-1β、IL-6、TNF-α 的降低更明显。研究设置假手术组，以排除造模对大鼠伤害对TLR4、TRAF6、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的影响。

综上所述，本研究结果显示夹脊电针可以改善CSR 模型大鼠的步态和抓杆情况，缓解了CSR 模型大鼠的疼痛，且抑炎作用明显。夹脊电针减少IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达，并抑制TLR4/NF-KB 信号通路是缓解CSR炎性反应的关键机制之一。由于本研究仅集中于单一途径与部分靶点，缺乏统一联系，限制了实验研究向临床应用的转化。在后续研究中，需要通过更多实验从其他新途径与新靶点进一步揭示夹脊电针治疗CSR的相关机制；同时通过大样本动物实验，对比研究不同取穴标准对于CSR 疗效的影响，以期为临床提供更多帮助。