溃结核心方对溃疡性结肠炎小鼠NF-κB/HIF-1α通路的影响*

黄 李 彭云花 陈 天 陆 宏 杨 巍

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的一个亚型［1］，临床表现以消化系统表现为主，包括腹泻、黏液脓血便、腹痛腹胀等。近年来的研究发现新兴工业国家中UC发病率迅速增加，其年百分比变化增长约14.9%［2-4］。STAUFFER JK 等［5］研究表明，内源性信号产物可诱导大量炎症介质产生，进而引发肠道免疫炎症反应，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子的大量激活，不仅阻碍肠道上皮屏障功能的修复，还会影响肠道菌群的平衡和代谢，加重UC。NF-κB/HIF-1α 信号通路是指在缺氧条件下，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和核转录因子-κB（NF-κB）相互作用，调节相关联的基因表达，并参与细胞的增殖、迁移、血管生成和炎症反应等。NF-κB 和HIF-1α 分别是炎症和缺氧疾病的关键转录因子，炎症主要激活NF-κB，而缺氧则与HIF-1α 信号通路密切相关［6］。当机体缺氧后，HIF-1α 活化，并刺激NF-κB P65 磷酸化上调，级联反应下促使了炎症因子的表达［7］。同条件下HIF-1α还被发现可介导NF-κB的活化，并通过TLR4依赖的方式促进LPS刺激巨噬细胞中NF-κB 调节细胞因子的表达，包含TNF-α、IL-1β等。溃结核心方（UCCF）是上海市名中医杨巍教授治疗UC 的核心基础方，主要由2 个药组组成：清热燥湿之黄芩、黄连、木香；健脾益气之黄芪、白术、茯苓。前期网络药理学研究已推测UCCF可能通过NF-κB/HIF-1α 信号通路对UC 发挥抗炎作用，为进一步验证这一理论，本实验采用小鼠进行动物实验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48 只SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠，周龄9～12 周，体质量（21±1）g，生产许可证编号：Q2714。环境恒温恒湿，光照符合规定，予普通饲料喂养，自由饮水。所有动物的喂养、操作、处死取材等均严格遵循上海中医药大学动物研究委员会伦理相关规定，实验方案经由上海中医药大学动物伦理委员会审核批准（伦理编号：PZSHUTCM220124014）。

1.2 试剂与仪器

UCCF 颗粒剂组成：黄芩15 g，黄连6 g，黄芪10 g，白术10 g，茯苓10 g，木香10 g。均购于上海中医药大学附属曙光医院中药房。美沙拉嗪肠溶片（葵花药业集团，国药准字H19980148），规格：0.25 g/片。葡聚糖硫酸钠（DSS）购于美国MP Biomedicals 公司。便隐血（FOB）检测试剂购于艾博生物医药有限公司，批号为2022110119；TNF-α 试剂盒购于Origene 公司，批号为20100929080；IL-1β 试剂盒购于武汉赛维尔公司，批号为GB11113；NF-κB 兔多克隆抗体、HIF-1α 兔多克隆抗体均购于Origene 公司，批号分别为W001、W112。UC7 超薄石蜡切片机（苏州赛恩斯仪器有限公司）；MS-PB 磁力搅拌器、KZ-Ⅱ高速组织研磨仪、BV-2 垂直电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；D3024R台式高速冷冻离心机（大龙兴创实验仪器公司）；Alpha-EaseFC灰度分析软件（Alpha Innotech公司）；7300实时荧光定量PCR 系统（美国ABI 公司）；Adobe PhotoShop图像分析软件（美国Adobe 公司）；ME203E/02 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

1.3 分组与造模

48 只小鼠适应性喂养1 周之后随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组及UCCF 低、中、高剂量组，每组8只。正常组小鼠每天饮用蒸馏水，其余各组均喂养4%DSS，自由饮水。通过DSS干预4 d，小鼠肠道炎症始现（大便不成形、隐血阳性、肛门糊状等），连续干预6 d即可构建急性UC模型［8］。

1.4 给药方法

在小鼠的饲养期间，其可以自由饮水，并注意清洁垫料，保持干燥。给药浓度计算方法参照《中药药理研究方法学》［10］，按照实验动物与人体质量计算给药剂量，将人每天剂量折算成小鼠等效剂量作为中剂量，高剂量即为2 倍，低剂量为1/2 倍，等效剂量为1.40 g/kg，小鼠灌胃量按照0.2 mL/10 g 计算，UCCF低、中、高剂量分别为0.8、1.6、3.2 g/（kg·d），药物使用前研磨至粉末状，加入蒸馏水充分溶解配制混悬液，于4℃冰箱冷藏，使用时提前水浴锅复温。美沙拉嗪组（阳性对照药）：成人UC 急性期美沙拉嗪肠溶片的用药剂量为4 g/d，换算成小鼠剂量为0.52 g/（kg·d）。从4% DSS 喂养第5 天开始予以药物干预，UCCF 低、中、高剂量组灌胃给予相应浓度的UCCF（2.5 g/kg），美沙拉嗪组小鼠给予美沙拉嗪肠溶片溶液（0.011 g/kg）灌胃，正常组和模型组予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，连续7 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 一般情况及DAI评分 实验期间每日观察小鼠的一般状况（体质量、粪便黏稠度并进行粪便隐血检测）。各组小鼠DAI 评分按照表1 的评分标准，计算公式为DAI 评分为3 项合计总分/3。DAI 值达到0.5 分及以上时，即可判定小鼠结肠炎造模成功［11］。

表1 DAI评分表

1.5.2 结肠长度及结肠病理学评分 第12 日前禁食12 h，然后称重、处死。剖取结肠、清洗后参照结肠病理学评分标准进行评分。0分为正常组织；1分为表面上皮损伤；2 分为局限于黏膜的灶性溃疡；3 分为灶性透壁性炎症和溃疡；4分为广泛透壁性溃疡和炎症，病变之间存在正常黏膜；5分为广泛的片状透壁性溃疡和炎症。

1.5.3 结肠组织病理学检测 取4%多聚甲醛固定的结肠组织，采用石蜡包埋、切片及HE 染色，显微镜下观察病理变化。

1.5.4 免疫组织化学检测 分别进行抗原修复、内源性过氧化酶阻断和封闭，然后先后进行一抗孵育、二抗孵育，放大信号后进行DAB 染色，细胞核染色，随后盐酸分化、返蓝、封片和拍片，采用Image J 图像分析系统对棕黄色颗粒（阳性表达）进行半定量分析。

1.5.5 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测结肠组织TNF-α、IL-1β、NF-κB、HIF-1α mRNA的表达 称取20 mg 冻存的结肠组织经液氮研磨，加入RNA裂解液进行总RNA提取，然后进行变性、冷却，再加入反转录液于PCR反应仪退火、延伸、失活。PCR扩增条件：95 ℃，30 s（循环1次）预变性，PCR反应条件为95 ℃，5 s，60 ℃，34 min 循环40 次，溶解曲线反应条件：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s，循环1 次。以β-actin 为内参，采用ΔΔCT 值方法，ΔCT=目的基因CT值-β-actin CT 值，ΔΔCT=ΔCT 实验组-ΔCT 对照组，目的基因相对表达倍数=2-ΔΔCT。该引物序列由武汉赛维尔生物科技有限公司设计，见表2。

表2 引物序列

1.5.6 蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测结肠组织NF-κB、HIF-1α蛋白表达情况 称取各组蛋白组织100 mg，加入裂解液，而后高速低温研磨，对其组织上清液进行蛋白浓度测量。加热蛋白使其变性后上机，先后电泳、转膜、封闭，TBST 洗膜3 次后加入相应1∶3 000 的二抗，室温孵育50 min 后重复洗膜3 次，最后发光显色。使用灰度分析软件AlphaEaseFC 和图片处理软件Adobe PhotoShop 分别对条带灰值进行数据分析和图像整理。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠体质量及DAI评分比较

见表3。正常组小鼠一般状况良好。模型组小鼠在造模的第4 天起出现腹泻，便中带血，部分小鼠肛门呈糊状，喜卧懒动、毛发杂乱黯淡。各用药组小鼠腹泻、血便情况明显减轻，精神状态可，毛发润泽度改善。给药前后，与正常组相比，模型组小鼠体质量均明显降低，DAI 评分均明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组相比，取材前的美沙拉嗪组和UCCF 中、高剂量组小鼠体质量都有明显上升，各用药组DAI 评分均明显降低；取材前末次体质量显示，正常组、美沙拉嗪组和UCCF 高剂量组体质量均较给药前有增高（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3 各组小鼠体质量及DAI评分比较（±s）

表3 各组小鼠体质量及DAI评分比较（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

体质量（g）组别正常组模型组美沙拉嗪组UCCF低剂量组UCCF中剂量组UCCF高剂量组n8 8 8 8 8 8造模前21.26±0.56 21.15±1.01 21.25±0.67 20.88±0.91 21.10±0.95 20.75±1.15给药前22.08±1.21 20.23±0.52*20.30±0.56*20.34±0.55*20.21±0.46*20.03±0.54*给药后22.23±0.43 18.85±0.52**19.63±0.37**19.30±0.68**19.78±1.28**19.89±0.49**末次体质量22.95±0.43 18.79±0.45**20.53±0.39*△△19.63±0.33**19.74±0.33**△20.36±0.72*△△末次DAI评分（分）0.08±0.14 2.42±0.46*0.42±0.36*△1.59±0.36*△1.13±0.41*△△0.29±0.31△△

2.2 各组小鼠结肠长度及病理组织学评分比较

见表4。结肠长度方差分析结果显示，各组结肠长度差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步比较，与正常组相比，模型组及UCCF 低、中剂量组的结肠长度显著缩短（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，UCCF 中、高剂量组和美沙拉嗪组的结肠长度显著延长（P＜0.01）；病理组织学评分方面，与正常组相比，模型组、美沙拉嗪组和UCCF 低、中、高剂量组小鼠结肠组织评分均显著升高，具有统计学差异（P＜0.01或P＜0.001）；相比于模型组，UCCF 高剂量组和美沙拉嗪组结肠组织评分差异有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组小鼠结肠长度及病理组织学评分比较（±s）

表4 各组小鼠结肠长度及病理组织学评分比较（±s）

组 别正常组模型组美沙拉嗪组UCCF低剂量组UCCF中剂量组UCCF高剂量组n8 8 8 8 8 8结肠长度（cm）10.15±1.01 8.45±0.52**9.49±0.62△△8.75±0.41**8.83±1.02**9.69±0.67△△病理组织学评分（分）0.13±0.33 3.13±0.93***1.88±0.60**△△2.38±0.99**2.25±1.09**1.88±0.33**△△

2.3 各组小鼠结肠组织病理学变化

见图1。正常组小鼠的结肠黏膜未发现明显病理变化；模型组小鼠出现了轻中度的结肠炎症损伤，炎症主要集聚于黏膜层和黏膜下层，模型组小鼠结肠正常隐窝结构被破坏，腺体扭曲，杯状细胞减少，排列紊乱；美沙拉嗪干预后的小鼠结直肠炎症损伤程度较模型组明显减少，大部分炎症局限于黏膜层，杯状细胞排列有序；UCCF 低剂量组、中剂量组结肠上皮已经修复，但腺体有轻度扭曲，炎症集中于黏膜；UCCF 高剂量组结肠上皮部分已经修复，腺体恢复状态良好，隐窝结构排列有序，未发现有淋巴细胞浸润的现象。

图1 各组小鼠结肠组织病理学变化（HE染色，200倍）

2.4 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β表达水平比较

见表5、图2。与正常组相比较，模型组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β 的mRNA 表达水平有显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），美沙拉嗪组和UCCF 中、高剂量组结肠组织中TNF-α、IL-1β 的mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。正常组小鼠结肠组织中的TNF-α、IL-1β 蛋白存在较少的阳性表达，且主要分布于结肠黏膜上；与之对比的模型组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β 蛋白的表达明显增多（P＜0.05）；与模型组相比，UCCF 高剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠黏膜中TNF-α、IL-1β蛋白的表达明显下降（P＜0.05），这与qRT-PCR结果一致。

图2 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β的表达（DAB染色，400倍）

表5 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β mRNA表达水平比较（±s）

表5 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β mRNA表达水平比较（±s）

组 别正常组模型组美沙拉嗪组UCCF低剂量组UCCF中剂量组UCCF高剂量组n8 8 8 8 8 8 TNF-α mRNA 18.42±0.73 30.12±0.82*19.94±0.87△24.23±0.49 23.80±0.77 21.80±0.55△IL-1β mRNA 11.14±0.50 43.55±0.90**24.33±0.95△37.60±1.0 36.30±0.90△21.90±0.90△

2.5 各组小鼠结肠组织NF-κB、HIF-1αmRNA和蛋白表达水平比较

见表6、图3。与正常组比较，模型组小鼠HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表达和蛋白表达明显上升，给药后美沙拉嗪组及UCCF低剂量、中剂量、高剂量组HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表达及蛋白表达发生逆转，表达降低，其中美沙拉嗪组及UCCF 高剂量组中HIF-1α、NF-κB 的mRNA 表达和蛋白表达显著降低，与模型组比较有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。

图3 各组小鼠结肠组织NF-κB、HIF-1α蛋白表达条带

表6 各组小鼠结肠组织NF-κB、HIF-1α表达水平比较（±s）

表6 各组小鼠结肠组织NF-κB、HIF-1α表达水平比较（±s）

组别正常组模型组美沙拉嗪组UCCF低剂量组UCCF中剂量组UCCF高剂量组n8 8 8 8 8 8 NF-κB mRNA 1.18±0.12 3.29±0.38**1.31±0.21△△2.36±0.19*△1.68±0.17△1.22±0.17△△HIF-1α mRNA 0.83±0.16 2.57±0.34**1.21±0.25△△2.02±0.17*△1.42±0.14△1.15±0.19△△NF-κB/βactin 0.28±0.03 1.0±0.02**0.53±0.04△△0.86±0.05**0.82±0.05**0.51±0.04△△HIF-1α/βactin 0.16±0.02 1.12±0.03**0.38±0.02△△1.02±0.05**0.98±0.04**0.31±0.02△△

3 讨 论

UC是一种炎症性肠病，其主要症状是结肠黏膜的溃疡和出血，较符合中医学“痢疾”“泄泻”的疾病特点。中医学认为，本病发病的诱因复杂，病程长，病情易反复，但总以湿热蕴肠、气滞血瘀为其基本病机。UCCF方中，君药黄芩、黄连苦寒以清热燥湿。关于黄芩，《神农本草经》有云“主诸热黄疸，肠澼泄痢”。黄连生用苦寒性强，长于清热泻火解毒，亦可用于多种湿热证，其清热燥湿之功甚于黄芩，尤擅清中焦之湿热。两药相须为用，使邪有出路，邪去则正安。臣药黄芪、白术甘温以健脾益气，乃补虚之经典药对。其中黄芪归脾肺经，具有补气升阳、利水消肿之效，可用于脾胃气虚证，白术长于补脾益气，燥湿利水，可用于脾胃气虚证及脾虚湿停之水肿、痰饮，是治疗痰饮、水肿之良药。另佐以茯苓利水渗湿，健脾宁心，木香升降诸气，使邪有出路。全方君臣分明，各有所主，具有清热燥湿、健脾利水之功。临证时常根据病情缓急、病机主次、脾虚、湿热等症状调整君臣剂量以达其效。

目前UC 的发病机制尚未明确，一般认为其与遗传、环境、患者结直肠微生物生态系统及肠道内异常的固有免疫、适应性免疫相关。国内外多年基础研究表明，NF-κB 家族在健康组织中起到控制组织稳态、协调细胞生长和分化、应对外部刺激反应等作用，ATREYA I 等［12-14］在相关研究中已证实了肠上皮细胞中NF-κB 活性的高度对调控正常肠道稳态至关重要，其活动失调与许多肠道疾病状态有关，如IBD 等。HIF-1 是一种能够适应缺氧环境的调节因子，它由HIF-1β 亚基和HIF-1α 亚基组成。ALBOGAMI SM等［15］在研究中表明HIF-1α 对氧敏感，在低氧条件下易活化，调控下游靶基因的激活和转录，启动一系列细胞对缺氧刺激的应激反应。炎症组织的常见特征是血管功能障碍和免疫细胞浸润导致的耗氧量增加，因此，肠道炎症与黏膜缺氧高度有关。BAILEY CM 等［16］研究表明，在炎症中，HIF-1α能调控免疫细胞存活，调节促炎因子TNF-α、IL-1β 等的表达。此外，TAYLOR M等［17］发现，NF-κB和HIF-1α是参与黏膜反应调节的2个主要核因子，HIF-1α在抑制炎症发生和固有宿主防御反应中起重要作用。CLAMBEY ET［18］研究表明HIF-1α 依赖的FoxP3 诱导在黏膜炎症性缺氧期间能够调节Tregs 细胞丰度和功能，特定条件下HIF-1α 可通过调节特定的信号通路，包括NF-κB、Akt 和mTOR等，促进FoxP3 的表达，有效调节T 细胞功能，对降低炎症表达、恢复内环境稳定有重要作用，并且保持免疫系统中的免疫耐受性，这可能是本次研究中UCCF 调节HIF-1α 进而参与抑制炎症反应的重要机制。本实验结果表明，模型组小鼠的DAI评分、结肠黏膜组织评分显著升高，结肠组织中促炎细胞因子TNF-1α、IL-1β 和NF-κB、HIF-1α mRNA 和蛋白表达水平明显升高，结肠长度下降，镜下可见小鼠黏膜上皮细胞出现诸多炎症细胞浸润导致的病理变化，表明NF-κB/HIF-1α 信号通路调节的炎症反应参与了UC 疾病进程。采用UCCF 治疗后，各剂量组小鼠DAI 评分、结肠黏膜组织评分以及结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、NF-κB、HIF-1α 的mRNA 和蛋白表达均明显降低，这证实了UCCF 可通过NF-κB/HIF-1α 信号通路调节炎症反应。UCCF 方中的黄芪被证实可抑制炎症因子表达，其内含的皂苷及类黄酮对阻断氧化应激反应也有重要作用。此外，UCCF 治疗后黏膜病理损伤明显改善，表明UCCF 对UC 有较好的治疗作用，可通过调节NF-κB/HIF-1α信号通路减轻炎症反应。

综上所述，UCCF 能够通过调节NF-κB/HIF-1α 信号通路，达到控制UC的目的。未来的研究可继续深入至细胞层面，对相关作用机制进行更加深入的研究。